文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
PFOS的肝脏和心脏发育毒性研究
姓名:万延建
申请学位级别:博士
专业:卫生检验与检疫
指导教师:徐顺清
2010-05
华中科技大学博士学位论文
胚胎期 PFOS 暴露的大鼠肝脏、心脏发育毒性研究
博士研究生: 万延建
导师: 徐顺清教授
中文摘要
PFOS 即全氟辛烷磺酸,是一种全球性的持续性有机污染物,可以通过食物链富
集,诱导多种毒性效应;且 PFOS 可以通过胎盘屏障,对子代的生存、生长发育影响
很大,所以对它的研究越来越多;近年来研究的热点是它的肝毒性(肝肿大,肝细胞腺
癌)和发育毒性(死亡率升高,生长发育迟缓),因为 PFOS 的这两种毒性效应比较显著。
但是,由于机体是由一个复杂调控网络构成,所以此两种毒性的机制尚不清楚,不同
的研究报道的结果也不尽相同,如 PPARα是否在肝毒性进展中的具有重要性,或肺
不张是否在出生后迅速死亡效应中的关键因素。
而近年来,由于表观遗传学的发展,研究发现许多疾病特别是肝损伤或肝癌均与
表观遗传改变相关,而发育毒性也与线粒体尤为相关。本论文以表观遗传毒性和线粒
体损伤毒性为研究途径,分别从肝脏细胞表观遗传效应中的 DNA 总甲基化和特异基
因甲基化水平改变与否的角度出发,研究 PFOS 肝毒性机制是否与其相关;另外,从
心脏线粒体损伤及相关核酸、蛋白分子水平研究角度出发,对 PFOS 的心脏发育毒性
的可能机制进行探讨。
第一部分、胚胎期 PFOS 暴露对大鼠出生后断乳期肝脏 DNA
总甲基化水平的影响
目的:研究对大鼠出生前暴露于 PFOS 与其出生后生长发育状况和肝脏可能发生
的 DNA 的甲基化修饰程度的改变之间的关系。方法:用阴道冲洗涂片法检测受孕情
况;在雌性 SD 大鼠受孕后的 2-21 天,对其进行不同剂量 PFOS(对照, mg/kg/d,
mg/kg/d, mg/kg/d)灌胃染毒;记录母鼠孕期生长速度和子鼠出生后的生存率和生
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长速度。子鼠出生后 21 天,即生长至断乳期,收集血清和肝脏器官样本。用 HE 染色
观测肝脏细胞正常与否;用液质联用法(LC/MS)检测血清和肝脏中 PFOS 含量;用
总甲基化检测试剂盒进行 DNA 总甲基化水平的检测;并用 BSP 产物纯化结合质粒克
隆后测序法检测 LINE-1 的甲基化状态;以及用 AP-PCR 方法评估 CpG 岛的甲基化状
态;最后用定量 PCR 检测 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的表达情
况。结果:母鼠孕期生长速度和子鼠出生后的生长速度在高剂量组均显著性减慢(p <
);总甲基化水平在最高剂量组有显著性降低(p < );测序显示 LINE-1 的甲
基化水平各组间无显著性差异(p > );AP-PCR 方法显示各剂量组的 CpG 岛甲基
化水平均与对照组有显著性差异(p < );另外,DNMT3a 在最高剂量组的表达水
平有显著性升高。结论:出生前暴露于 PFOS 降低大鼠出生后的生存率和减慢其生长
发育速度;大鼠出生后 21 天肝脏总甲基化水平的降低也与出生前 PFOS 暴露水平相
关,CpG 岛甲基化水平降低也与出生前 PFOS 暴露水平相关。
关键词:PFOS,发育毒性,DNA 甲基化,CpG 岛
第二部分、胚胎期 PFOS 暴露引起出生后大鼠肝组织中
个体基因甲基化状态改变的研究
目的:PFOS 能够引起一系列肝脏毒性和发育毒性,但目前机制尚不明确。本研
究试图论证 DNA 甲基化水平是否与 PFOS 诱导的肝毒性早期过程相关;尤其是是否
能发现相关的 DNA 甲基化方面的生物标志物,用于早期毒性的判断。方法:在雌性
SD 大鼠受孕后的 2-21 天,对其进行不同剂量 PFOS(对照, mg/kg/d, mg/kg/d,
mg/kg/d)灌胃染毒;在子鼠出生后 21 天,即断乳时,收集肝脏组织样本。用 HE
染色观测肝脏细胞正常与否;用亚硫酸氢钠测序 PCR 法(Bisulfite sequencing PCR,
BSP),即 BSP 产物纯化结合质粒克隆后测序法检测 GSTP(谷胱甘肽 S-转移酶 pi)、p16
等特定的可能为标志性基因启动子区域的甲基化状态;最后用定量 PCR 检测 GSTP
等基因的表达情况。结果:虽然显微镜下未见明显的肝组织病理学(肝细胞肿大,空泡
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化等