文档介绍：Western Blot 1. 注意一定要将玻璃板洗净,最后用 ddH 2O 冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 2. 分离胶及浓缩胶均可事先配好(除 AP 及 TEMED 外), 过滤后作为储存液避光存放于4℃,可至少存放 1个月,临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡,有条件者可真空抽吸 3分钟),加入 10%AP ( ~:100, 分离胶浓度越高 AP 浓度越低, 15% 的分离胶可用到 :100 )及 TEMED (分离胶用 :1000, 15% 的可用到 :1000 ,浓缩胶用 :1000 )即可,如室温较低可升高 10%AP 及 TEMED 浓度到《分子克隆》建议浓度。 : 灌入 2/3 的分离胶后应立即封胶,胶浓度< 10% 时可用 % 的 SDS 封,浓度> 10% 时用水饱和的异丁醇或异戊醇,也可以用 % 的 SDS 。封胶后切记,勿动。待胶凝后将封胶液倒掉,如用醇封胶需用大量清水及 ddH 2O 冲洗干净,% 的 SDS ,目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉 SDS ,将玻璃板倒立放置片刻控净。 1h拔除梳子,注意在拔除梳子时宜边加水边拔,以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用 ddH 2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶,随后用 % 的 SDS 封胶。若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正;若变形严重,可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。 30min 后即可上样,长时间有利于胶结构的形成,因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 (定性): ⑴去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍(冷的 PBS 有可能使细胞脱落)。⑵对于 6孔板来说每孔加 200~300 μl, 60~80 ℃的1× loading buffer 。⑶100 ℃, 1min 。⑷用细胞刮刮下细胞后在 EP 管中煮沸 10min ,期间 vortex 2~3 次。 10% 的 AP 最好现配现用,如在 4℃存放勿超过两周。 30% 的丙烯酰***如有沉淀,最好弃掉。⑸用干净的针尖挑丝,如有团块则将团块弃掉,如果没有团块但有拉丝现象,则可以将 EP 管置于 0℃后在 14000~16000g 离心 2min ,再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠,可通过使用 1ml 注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度,便于上样。⑹待样品恢复到室温后上样。 (定量): ⑴去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍(冷的 PBS 有可能使细胞脱落)。⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min 。⑶用细胞刮刮下细胞,收集在 EP 管后超声( 100~200w )3s,2次。⑷12000g 离心, 4℃, 2min 。⑸取少量上清进行定量。⑹将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀后加 loading buffer 后直接上样最好, 剩余溶液(溶于 1× loading buffer ) 可以低温储存, -70 ℃一个月, -20 ℃一周,4℃1~2 天,每次上样前 98℃, 3min 。 : ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每 50~100m