文档介绍：ELISA 操作步骤（双抗体夹心法）
包被过程（注意设置空白对照 , 阴性对照）:
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100",置37C,4h,或4c,24h;
弃去孔中液体，（为避免蒸发 , 板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中）。
PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。
具体为 . 吸干或甩干孔内反应液； . 用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸
泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液
体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； . 重复操作涤 3 次。
加入待检测样品（建立合适的浓度梯度）:
检测时一般采用 1:50-1:400 的稀释度 , 应采用较大稀释体积进行 , 一般保证样品吸取
量＞20科l。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔 100^1,置于
37℃ ,40-60min 。
PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。
加入酶标抗体 :
酶标抗体 : 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度， 37℃ ,30-60min 之
间，短于30min往往结果不稳定，每孔加 100科1。
PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。
加入底物液（现用现配）:
TMB（四甲基联苯胺）使用液：TMB（10mg/5ml无水乙酉I）（）
%H2O2 32 ”，底物加入量每孔 100“（TMB空白显色孔除外），置37c避光放
置 20-25 分钟。
终止反应 :
每孔加入终止液 50 “（2M H2SQ）终止反应，此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
结果判断 :
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无
色或极浅。也可测吸光值：在 ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要 450nm波长，检测时
一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比
值（P/N）表示，当 P/N 大于 2 时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的 2 倍，（数值的大小
依具体检测要求而定）。