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血清清蛋白、γ-球蛋白的别离纯化与鉴定
〔一〕血清清蛋白、γ-球蛋白的别离与纯化
【目的要求】
1．了解蛋白质别离提纯的总体思路。
2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】
血清中含有清蛋白和各种球蛋白〔α-β-γ-球蛋白等〕，由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀别离，此法称为盐析法。本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步别离。在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。
用盐析法别离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会阻碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH ，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白〔、〕，而γ-球蛋白〔〕在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及局部a-球蛋白可被洗脱下来。将醋酸铵溶液的浓度提高至，那么清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于鉴定，常需浓缩。浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白别离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
【试剂与器材】
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〔1〕饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g参加1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。
〔2〕醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵,加蒸馏水800mL，用稀氨水或稀醋酸调pH至，定容至1000mL。(不得加热)
〔3〕醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释5倍。
〔4〕醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释3倍。
〔上述3种缓冲液要确保浓度和pH的准确性，稀释后要重调pH〕
〔5〕300g/L三氯乙酸 〔6〕纳氏试剂
〔7〕葡聚糖凝胶G-25 〔8〕DEAE纤维素
〔9〕新鲜血清 〔10〕聚乙二醇
〔11〕双缩脲试剂
离心机 刻度离心管 pH试纸 抽滤瓶 黑、白反响板 透析袋
铁架台 层析柱×20cm〕 移液枪 布氏漏斗 培养皿
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【操作方法】
1. 硫酸铵盐析
〔1〕取刻度离心管1支，参加mL新鲜血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵液mL。混匀后室温下放置10min，4000r/min离心10min。用滴管