文档介绍：宏基因组文库构建
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什么是文库？
Library
基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合，就像一个没有目录的“基因图书馆”
基因文库的组成：
外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA
载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体（BAC、YAC）等
宿主：大肠杆菌（）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）
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,
n=ln(1-p)/ln(1-f)
n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数
p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率
f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值
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哺乳动物 3×109kb
若p=99% 平均克隆片段20kb
f=20kb/3×109
n=
4639221bp
p=99% f=20kb/4600kb
n=
p=99% f=10kb/4600kb
n=2116
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若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库
cDNA文库:
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可装载的外源DNA
Plasmid <10kb
λ Phage 0-23kb
Cosmid ~45kb
BAC ~ 100kb
YAC ~ 300kb-
载体的选择：
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粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半，如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比λ phage困难得多
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YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
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基因克隆的策略
基因克隆的本质
从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”
常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体
广义: 还包括其他筛选手段
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抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活性
一、功能筛选
分解基因: 苯环化合物, 分解酶
功能活性：杀虫，酶
启动子/复制子
利用目标基因的特定功能进行筛选
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