文档介绍：上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(2)
课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48
专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强
内容
质粒转化大肠杆菌、阳性菌落扩增、质粒小量制备
时数
12
本次课目的要求
掌握质粒转化大肠杆菌理论与技术。
掌握阳性菌落扩增,质粒小量制备理论与技术。
本次课的重点难点
质粒转化大肠杆菌技术。
涂皿鉴定技术。
阳性克隆扩增技术。
少量质粒制备技术。
本次课的应用教具
质粒转化大肠杆菌实验及有关仪器设备。
阳性菌落扩增,质粒小量制备实验及有关仪器设备。
实验26
质粒转化大肠杆菌
该实验主要有两个用途:
。当质粒的重组或其它载体重组后,通常会发生质粒的重组失败,包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因,一旦重组成功,质粒环化(包括自身环化),抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力,可以含该抗生素的培养基中生长传代,不然,重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。
。由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟,而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝,因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可以在短时内极大地扩增目的质粒。(作为分子生物学用大肠杆菌,是经过实验室改造过的工程菌。)
原理
本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42℃的温度时,大肠杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落。
实验准备(略)

实验步骤
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌,插入湿冰中溶解约15分钟,轻轻混匀。,并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌 50 ul
DNA 5 ul
轻轻混匀,静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌45秒,迅速移入湿冰中,静置2分钟,加入900ul LB培养液,放入37℃恒温箱摇床,225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培养箱中过夜。
次日,检查各培养皿中是否出现菌落。
实验结果
转化成功,培养皿中可见散在的菌落,其中加入100ul培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的一倍。
转化失败,培养皿上无菌落,或菌落布满如苔样,后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。
注意事项
,因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等,要求明确以准备适宜的抗生素板。
,由于琼脂板含有抗生素,所以当实验环境干净者,可以直接放在普通实验台上操作。
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