文档介绍：一抗，该怎么孵？
为什么实验室中最常用的 WB (Western blot)实验看起来较难重复？为什么同样样品同样配方师兄师姐却技高一筹？如何才能确保我实验结果的可重复性？可能原因有很多，本文主要讲一抗该怎么孵？
一抗稀释缓冲液一一取决于抗体特异性
一抗应在含5%BSA或5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中稀释。每种抗体都预先确定了最佳稀释缓冲液，并写入了各产品的说明书，请遵照产品说明书进行配制，从而得到最佳的信号。
Milk BSA
Phaspba-
Aid ($er473)
kDa
血
100
90
90
例如(A)，免疫印迹分析胰岛素处理过的 C2C12细胞提取物，采用Phospho-Akt (Ser473)Antibody #9271。遵照说明书，用基于BSA缓冲液稀释得到信号显著强于基于牛奶的缓冲液。
1Bhr,49C
Phospho- AM(Sar473)
一抗孵育时间会有很大的差别
小时，随后在4C下进行过夜一抗孵育。此处或室温条件下2小时孵育。
孵育一一过夜孵育提高抗体结合
具体取决于研究人员采用的操作流程。我们建议转移之后封闭一
(B,C)所示为抗体性能的两个实例，4C过夜孵育
例如(B)，免疫印迹分析HeLa细胞提取物，未经处理或加入 LY294002 #9901或Human Insulinlike Growth Factor I (hIGF-l) #8917 处理，采用 Phospho-Akt(Ser473)Antibody #9271 (上)和 PKC S Antibody #2058 (下)。Phospho-Akt(Ser473)和 PKC S都在 4°C 过夜孵育中表现更佳。
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简短孵育系统孵育时间越短产生信号越弱
宣传简短抗体孵育时间的系统越来越流行，因为它们能减少免疫印迹结果所需时间。使用这些系统时，应遵循生产商推荐的操作流程并使其最佳化。这些操作流程通常要求较弱的封闭缓冲液和较高一抗