文档介绍：PCR 扩增失败的原因分析 2010-12-13 16:48:31| 分类: 默认分类|字号订阅 PCR 扩增失败原因分析, PCR 产物电泳 2010-05-15 16:07 一模板质量问题: 1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的 DNA ,PCR 阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题,可以增加模板量试试,但不一定行得通。 2)模板里面残留某种试剂成份,可能抑制 Taq 聚合酶的活性,如果是这种情况, 可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3)为什么跑电泳会出现拖带呢? 。电泳跟很多因素有关,其中就有一个是电压,在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率,但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。。你看能否回收之后, 按1:50 或1:100 等稀释后,再当成模板扩一次怎么样。二引物问题 1)样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利! 2)普通 PCR 所用的一对引物中有一个引物加多了,为正常的三倍只要引物特异性比较好,那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话,也许会扩出来非特异带。在制备单链探针时候就采取这样的不对称 pcr ,没关系的三Taq 酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。 tap 酶种类高特异性 Taq 酶高度特异性地扩增所需的片段是 PCR 最基本的要求,影响 PCR 特异性的因素很多,包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等,而高特异性 Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程,也为 PCR 产物快速有效的纯化(PCR 产物直接纯化)打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动 Taq 酶。大家都知道,在PCR 第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时 Taq 酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动 Taq 酶是必需经过高温才能激活的酶,因此在初始循环的变性之前它没有活性,不会产生非特异性扩增,这就大大提高了 PCR 扩增的特异性。第一代热启动 Taq 酶往往直接在 Taq 酶上做一些修饰,比如用抗体抑制,蜡封等,如Clontech 、Stratagen 、Gibcol-LT I 的一些产品,由于抗体、蜡等异物的掺入,对实验造成一定的影响,也给试验者带来一些不便。新一代的热启动 Taq 酶是通过内部改造的重组酶,真正实现便利的热启动,代表产品如 QIAGEN 公司的 HotStar 系列,无需别的辅助抑制物,也不用担心抑制不稳定,使用起来方便、高效。此外,由于几乎所有的 Taq 酶产品都带有相应的反应缓冲液,缓冲液的品质也对保证 Taq 酶特异性扩增起着不可忽视的作用,一般的缓冲液中调节 H键作用的盐只有 KCl ,QIAGEN 公司的缓冲体系通过 KCl 、(NH4)SO4 盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。此外,热启动的 Taq 酶也是实现一步法 RT-PCR 的基础。如 QIAGEN 公司的 OneStep RT-PCR 试剂盒,在 RT反应较低温度下, Taq 酶没有活性,逆转录酶发挥活性; RT反应结束,高温灭活逆转录酶的同时,激活 Taq 酶,进行 PCR 反应。另一家公司 Epicentre 有一种 MasterAmpTM Tth DNA 聚合酶,本身就具有逆转录酶活性,也可用作 RT-PCR 。高保真 Taq 酶下游应用为基因筛选、测序、突变检测,分子诊断等等的用户,往往对 PCR 保真性要求很高,保真性的一个通用标准是错配率,错配率越低保真性越好。普通Taq 酶的错配率在 2-5X10-5 碱基/循环数,而高保真 Taq 酶错配率可达 10- 6 数量级,大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真 Taq 酶具有 3'到5' 核酸外切酶(Proofreading )的活性,扩增途中如果产生了错配的碱基,它可以将其切掉,从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能,往往扩增效率低一些,有的还容易降解引物,且产物一般不宜用 TA或 UA克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品,一类是混合型的高保真酶,将带有Proofreading 活性的酶与普通 Taq 酶(用于提高扩增效率)混合起来,错配率在 8-9 X10-6 碱基/循环数。 Clontech 、LTI 等公司都有此类产品。如果要求更高的