文档介绍：细胞工程复****资料 1 原代培养——直接取自动植体的组织或细胞的培养。 2 传代培养——从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。 3 接触抑制——将多细胞生物的细胞进行体外培养时, 分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触,即停止移动并抑制生长的现象。 4 密度抑制——虽发生接触抑制, 只要营养充分, 细胞仍然能够进行增殖分裂, 但当细胞密度进一步增大, 培养液中营养成分减少, 代谢产物增多时, 细胞因营养的枯竭和代谢物的影响, 则发生密度抑制。 5 细胞系(cell line) ——原代细胞经第一次传代后, 形成的细胞群体, 即具有增殖能力,类型均匀的培养细胞,一般为有限细胞系。 6 细胞株(cell strain) ——细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 7 动物细胞培养的条件: 充足的营养供给、适宜的温度、适宜的 pH 和气体环境。无菌、无毒的环境。 1 )恒定的温度:37 ℃维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为 ℃± ℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。 2) PH : -7. 4当 PH 低于 6 或高于时的生长会受到影响,甚至死亡。 3) 气体: ?所需气体主要有氧气和二氧化碳。?氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。? CO2 有调节 PH 的作用。 4)营养—培养基: 在保证细胞渗透压的情况下, 培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养,如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件,细胞才能在体外正常存活、生长。 8 细胞培养实验室: ?专用于组织细胞培养的空间,应包括更衣间、缓冲间、操作间。?内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备,应具备紫外消毒、通风及温控设施。?操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。?缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等 9 细胞保存原则:慢冻快融冷却过慢, 胞外溶液水分大量结冰, 渗透压增大, 胞内水分大量渗出化学损伤冷却过快,胞内水分来不及向细胞膜外渗出,胞内溶液中的水分结冰物理损伤在细胞冻存时加入冷冻保护剂,可以保护细胞免受冷冻损伤。原理: 1). 常用的低温保护剂是甘油和二***亚砜( DMSO ) ,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,降低细胞的冰点 2). 提高胞膜对水的通透性, 促进细胞内水渗出细胞外, 减少细胞内冰晶的形成,从而减少冰晶对细胞的损伤;解冻时,促进细胞外水进入细胞内,缓解渗透性肿胀。 3). 稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质,减少溶质损伤。 10 配制冻存保护液: 在含 20%—30 %的小牛血清的 1640 培养基中加入二甲亚砜, 使其终浓度为 10%( 或者加入甘油并使终浓度为 5%)。 11 细胞融合——又称体细胞杂交, 是指将不同来源的原生质体( 除去细胞壁的细胞) 相融合将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。 12 杂交细胞——在适当的条件下,细胞融合在一起,产生具有原来多个细胞基因信息的单个核细胞,称为杂交细胞种内杂交细胞——同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞——不同种的细胞融合而成的细胞 13 非对称细胞融合——利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。 14 常用的诱导方法有三种: 1. 生物法(病毒诱导法等) 2. 化学法( PEG 诱导法、 Ca 2+ 诱导法、溶血卵磷脂诱导法等) 3. 物理法(电诱导法等) 15 自发细胞融合——是在未施加任何诱导条件的情况下所发生的细胞融合现象。 16 人工诱导细胞融合是在人为条件下发生的细胞融合现象 17 自发细胞融合现象在自然界中并不多见,常见的主要有以下几种情况: 1. 精子和卵子受精2. 肌管的形成3. 胚胎着床4. 6. 肿瘤细胞融合 18 动物细胞融合影响因素: ①亲本细胞表面性质影响较大②细胞种类不同,融合效果也不同③细胞融合时需要适宜温度和运动状态④细胞融合过程中,通常耗氧量较大,缺氧时经常不融合。⑤有些细胞融合时需要 Ca2+ ,否则不融合,细胞蛋白质亦发生变化。⑥最适合的 pH 为 - 之间,在此范围之外,融合率均较低。 19 杂种细胞筛选方法:(1 )遗传互补筛选法( 2 )营养互补筛选( 3 )温度敏感筛选法 1) 遗传互补筛选法: 利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因, 纠正另一亲本的缺陷,令杂种细胞表现正常。?亲本 A: HGPRT- /TK+ ?亲本 B: HGPRT+ / TK- ?杂交细胞: HGPR T+ / TK+ 在 HAT 培养基中杂交细胞存活, A、B死亡 2) 营