文档介绍：丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(cèdìng)
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【目的(mùdì)要求】
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【实验原理】
血清(xuèqīng)中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-***戊二酸生成谷氨酸和***酸：
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生成的***酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成***酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境(huánjìng)中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与***酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的***酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。
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尽管基质液中余下的a-***戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如***酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎协作(xiézuò)会议也建议统一使用改良赖氏法。
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取干净试管12支，按下表所示标号(biāohào)，要求各S管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。
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【实验结果】
(即计量反应(fǎnyìng)曲线) 在坐标纸上以上表中An－A 0之值为纵坐标，相应的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法测定ALT的标准曲线
⑴查标准曲线利用测定所得的吸光度结果(AU－AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果
⑵计算将实验测得的AU－AB 、AS 代入下面计算公式，即可算得标本中ALT活性
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【方法评价】
ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下：
由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床(lín chuánɡ)化验室推广。
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二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol***酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=，37℃条件下与底物作用30 min，***酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示(biǎoshì)的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，，波长340nm，光径1cm的条件下，。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示(biǎoshì)酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位= IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
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改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良(gǎiliáng)赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-***戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中***酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的***酸和未用完的a-***戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
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