文档介绍：生物化学实验报告
姓名：杨晓霞
学号： 3120040025
专业年级： 2012级口腔
组别：第一实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
(Title of Experimetn)
质粒DNA的提取、定量、
酶切与PCR鉴定
实验日期
(Date of Experiment)
2013-11-22
实验地点(Lab No.)
第一实验室
合作者(Partner)
黄尧
指导老师(Instructor)
周珏宇
总分
(Total Score)
教师签名(Signature)
批改日期
(Date)
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】
一、实验原理：
①PCR：即聚合酶链式反应。是指在DNA聚合酶催化下，按照半保留复制的机制以DNA为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数级递增的过程。
a．变性：加热反应系统至90℃-95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
b．退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C．延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
②质粒DNA的提取与制备：
a．碱裂解法：根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异，在高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性，当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，染色体DNA
不能复性而形成缠连的网状结构，与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起成为沉淀，而变性的质粒DNA复性并保存在溶液中。
b．离心层析柱：首先，硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；然后，通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；最后，低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
③质粒DNA的定量（紫外分光光度法）：由于物质在光的照射下会产生对光的吸收效应和物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。DNA分子中由于碱基上存在共轭体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收强度与溶液中DNA的浓度成正比。
④质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地结合于一段被称之为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。
⑤琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。而DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于电荷效应与分子筛效应，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，因其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。其中，DNA迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
二、实验材料
实验样品：PCR：菌液
质粒DNA的提取与制备：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α
质粒DNA的定量：提取的质粒DNA溶液
质粒DNA的酶切鉴定：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T)
琼脂糖凝胶电泳：提取的质粒DNA溶液、PCR扩增后的DNA片段、酶切后的DNA片段
主要试剂：PCR:灭菌去离子水、2*Premix、引物1-SO100 (10 mmol/L) 、引物2-SO101 (10 mmol/L)
质粒DNA的提取与制备：LB培养基（液体、固体）、Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）、溶液 P1 、溶液 P2、溶液 P3 、去蛋白液 PE、漂洗液 WB、洗脱液 EB
质粒DNA的定量：灭菌的去离子水
质粒DNA的酶切鉴定：无菌水、10×M酶切缓冲液、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I (12U/ul)
琼脂糖凝胶电泳：电泳指示剂、Gelview 、TBE、琼脂糖、 DNA Marker 5000
主要仪器与器材：PCR：PCR仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管
质粒DNA的提取与制备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅
质粒DNA的定量：紫外分光光度计（ep