文档介绍：EPSP （5-烯醇式***酰莽草酸-3-磷
酸，5-enolpyruvylshikimate -3-phosphate）合成酶基因
（aroA, 1. 3kb）克隆、定点突变
1 PCR引物
所有引物由申能***公司负责合成：
（1） aroA基因的PCR引物
Primerl （上链）：5'-ATCTCTAGAATGGAATCCCTGACG-3'
Primer2 （下链）：5'-GTTGAGCTCTCAGGCTGCTTG-3'
（2） aroA突变G-A引物
Primer3 （上链）：5，-TTGTTCCTCGGTAACGCCGCAACGGCAACGCGTCC-3， Primer4 （下链）：55- CAGCGGACGCGTTGCCGTTGCGGCGTTACCGAGGA-35

LB培养基：每升含胰蛋白月东10g,酵母提取物5g, NaCl 10g。用NaOH调pH至 ,灭菌后待用。%琼脂配成固体培养基。
3实验仪器
SIGMA冷冻离心机，高压灭菌锅，ZF紫外透射分析仪，凝胶电泳成像仪,
电泳仪，水平板电泳槽及梳子，PCR仪，移液枪及枪头和各种eppebdorf。
实验步骤与实验方法
2. 1细菌基因组DNA的小量制备
材料
TE缓冲液
10% （w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）
20mg/ml蛋白酶K
5mol/L NaCl 溶液
CTAB/ NaCl 溶液
24： 1***仿/异戊醇
25： 24： 1酚/***仿/异戊醇异丙醇
70%乙醇
步骤
培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1. 5ml的培养物12000rpm离心15min。
沉淀物加入567 u 1的TE缓冲液，用吸管反复捶打使之重悬。加入30 u 1 10% 的SDS和3u 1 20mg/ml的蛋白酶K,混匀，于37°C温育lh。
加入100U 1 5 mol/L NaCl,充分混匀，再加入80 u 1 CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65°C温育lOmino
加入等体积的***仿异戊醇，混匀，离心4min。将上清液转入一个新管中。
加入等体积的酚/***仿/异戊醇，混匀，离心5min,将上清转入一只新管中。
加入0. 6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心去上清，用70% 乙醇中洗涤。
离心5min,弃上清，自然干燥，重溶于30 u 1的TE缓冲液。
2. 2 PCR反应
2. 2. 1 aroA基因的PCR扩增:
(1)在 0. 5ml Eppendorf 管中加入：
ddH20
2u 1
10XPCR Buffer
3u 1
MgCl2 (25mM)
3u 1
dNTP (10 mM)
0. 8u 1
primer 1 (lOpmol/u 1)
1 u 1
primer 2 (lOpmol/u 1)
1 u 1
模板基因组
2u 1
Taq 酶(5U/u 1)
1 u 1
30 u 1
石蜡油
30 u 1
反应程序为：94°C
4min
94 °C
30s
56. 1°C
90s
72 °C
120s
72 °C
10min
34个循环
PCR产物经电泳鉴定并kit纯化。
2. 2. 1. 1 0. 8%琼脂糖