文档介绍：质粒抽提陈继胜★质粒的重要性?质粒是宿主细胞引入外源基因的主要方法! ?质粒是下游生物技术(如蛋白表达,药物筛选,细胞和组织研究)的基础!质粒的结构影响下游实验的成功率,特别是涉及到蛋白和基因的相互作用时! ?质粒是我们发给客户的最终产品! ★质粒抽提的方法?碱裂解法抽提质粒?煮沸法快速提取质粒★碱裂解法抽提质粒的原理: 在 pH ~ 碱性环境中,细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开,而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐条件下,大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀,而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质,质粒 DNA 尚在上清中,然后再进一步纯化质粒 DNA 。首先以 Axygen 小抽试剂盒介绍一下试剂的成分: 溶液 I: 50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA , pH ; RNAse ;溶液 II: N NaOH / 1% SDS ; 溶液 III:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸; Wash solution W1:Proteinse K; Wash solution W2: 乙醇; 溶液 I的作用?首先要控制溶液的 pH ,因此用适当浓度和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液, 50 mM 葡萄糖起到使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积底部。 EDTA 是 Ca2+ 和 Mg2+ 等二价金属离子的螯合剂,主要作用是:抑制 DNase 的活性。在溶液 I中加入达 10 mM 的 EDTA ,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。溶液 II作用?用新鲜的 N的 NaOH 和2%的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备的 NaOH 。破细胞的主要是碱,而不是 SDS ,所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从 bilayer (双层膜)结构向 micelle (微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的 N NaOH ,即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下),自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒,因为 SDS 也是碱性的,只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性, 以便沉淀。有人不禁要问,既然是 NaOH 溶解的细胞,那为什么要加 SDS 呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点: 第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合, 不然基因组 DNA 也会断裂。溶液 III ?溶液 III加入后就会有大量的沉淀。沉淀是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质还有基因组 DNA 。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。中和后的离心去蛋白- 一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面,继续离心的效果并不好;而将上清倒入另外一个离心管中,再离心,效果要好许多。★氨基化二氧化硅晶体粉末吸附法由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的 pH 环境下的ζ(zeta )电位为正值,与带负电荷的质粒 DNA 通过静电结合能快速形成纳米颗粒-质粒 DNA 复合物,并对结合的 DNA 有明显的保护作用★苯酚/***仿分离蛋白质和核酸法? 按***仿:异戊醇= 24:1 体积比加入异戊醇。***仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。?按体积/体积= 1:1 混合上述饱和酚与***仿即得酚/***仿(1:1) 。