文档介绍：南方医科大学
硕士学位论文
补肾壮骨中药对模拟微重力成骨细胞的影响
姓名:衷锐
申请学位级别:硕士
专业:内分泌与代谢病
指导教师:黄震;蔡德鸿
20090501
补肾壮骨中药对模拟微重力成骨细胞的影响硕士研究生:衷锐指导教师:黄震蔡德鸿摘要研究背景T谑е胤尚幸鸬囊幌盗腥颂迳硐低潮浠校渌硐低车谋是影响宇航员健康的主要问题。已证实失重性骨质疏松的骨丢失主要是由于骨理想的效果,因此预防失重性骨丢失的研究已成为国内外航天医学领域的重点主骨生髓怠!兑骄濉啡眨骸吧霾鼐ǎ瑁枭牵使钦呱鲋所以合也,髓者,肾精所生,精足则髓足,髓在骨内,髓足则骨强。股鲎骨中药主要由淫羊藿、生地黄、补骨脂、川续断等组成。我们将中医药理论运用于航天医学研究,在前期的整体实验中我们已经从骨密度、骨生物力学、骨组织形态学、骨生化学各角度对补肾壮骨中药进行了深入研究,证明其对尾吊模拟失重大鼠骨丢失有明显的改善作用。但其在细胞学上改变尚不明确,故本实验选择中药复方仙灵骨葆胶囊制备含药血清。复方仙灵骨葆胶囊是富含植物失重即微重力,是物体只表现为质量而不表现为重量的特殊力学环境化在航天飞行中会达到一种新的平衡状态,返回地面后,经过一段时间可以很快恢复。但骨钙的丢失却持续发展,引起失重性骨质疏松。骨代谢的调节失衡形成的减少而不是骨吸收的增加。目前航天中采用的各种对抗措施均未能起到和热点课题。我国传统医学,博大精深,已证实对原发骨质疏松症有较好的疗效及较强的优势。补肾疗法是中医治疗骨质疏松症的重要方法,其理论基础源于中医“肾硕士学位论文
目的对象和方法雌激素的草药制剂,分别含有金雀异黄酮怠⒋蠖够扑藿佟⒉构侵俸鸵觳构侵畉∥蔷哂写硇缘姆郊之一。本实验在研究补肾壮骨中药对失重骨代谢影响整体实验的基础上,观察了该方对体外模拟失重培养的成骨细胞的影响,拟揭示该方对抗骨丢失的细胞学改变。本研究主要从细胞学层面上探讨补肾壮骨中药对模拟失重条件下体外培养成骨细胞的影响,拟在细胞水平上揭示该方对抗骨丢失的机制,以期为失重性骨质疏松的临床治疗研究提供新的线索。晒窍赴姆掷搿⑴嘌⒗┰觯喝⌒律鷏大鼠乳鼠,无菌条件下取颅顶骨,去除周围组织;培养基漂洗后将其剪碎成小于删乃槠经ヒ鹊鞍酌冈は,间断振荡,弃上清;加入ヒ鹊鞍酌和%徒涸富旌弦海恒温孵育箱内消化间断振荡,取上清液离心,收集细胞接种于含%胎牛血清的培养液中,置℃培养箱内培养,第首次换液,第首次传代。以后每换液一次,传代一次。台盼蓝染色记数检测原代细胞悬液活细胞率。依据贴壁培养法分离和扩增成骨细胞,绘制细胞生长曲线,取前赴魑J匝对象。晒窍赴δ芗ǎ翰捎酶牧糋祁芊ḿ钚粤姿崦染色观察,痵矿化结节染色法检测体外矿化能力。捶街幸┖┭G逯票福喝〗】敌坌許笫蠊唬婊治组。用药组只,均灌胃给药捶较闪楣禽峤耗一日瘟次,于末次给药后小时,乙醚麻醉无菌条件下经腹主动脉采血,冷置后离心分离血清,经℃:┭G澹浔中文摘要痝、淫羊畉Ⅱ
结果瓵、钚圆舛ǎ憾韵趸椒臃ú舛ê┭G遄饔后培养液中在相差显微镜下呈三角形、菱形、多边形等不规则形状,透明度好。细胞有触成团的现象。胞核大而清楚,呈圆形或卵圆形,含个核仁。组织块培养法第欤怪孟晕⒕迪驴杉罅砍晒窍赴幼橹橹鼙吲莱觯嘌天,移出的细胞明显增加,以骨块为中心,向周围呈放射生长,间杂成纤维细胞后期用差异贴壁法分离纯化。旌笙赴酒搪ゲ悖蛔橹榕嘌ㄐ硕士学位论文存备用。正常对照组和模拟失重组,各唬聪嗤绦蚬嗟忍寤⊙清是为正常血清,作为对照用。大鼠灌胃给药剂量均按人日用临床剂量,经人一大鼠体表面积比值折算成相当于临床剂量,以读扛⒛D馕⒅亓Τ晒窍赴P汀⒎肿楦稍ぃ菏笛榉治U6哉兆椋е模型组和含药血清不同浓度组,将微载体×龀晒窍赴尤胄J生物反应器中,添加含%%对照血清蚝┭G澹张ǘ确直鹞ァァ的培养基至,排空气泡。调整转速使细胞与微载体的黏附物能随反应器内外筒一起以较为理想的运行轨迹与转筒一起运动后,逐渐加大转速直至相当于奈⒅亓ψ刺。置于。恒温孵育箱中培养钚裕派涿庖卟舛ǚú舛˙活性。晒窍赴蛲黾觳猓合赴稍づ嘌后,胰蛋白酶常规消化,制成细胞悬液,吹蛹复危赴匦腂,加入和,混匀,避光室温反应尤,用流式细胞仪检测粜韵赴晒窍赴で榭觯壕傲讲较蛔橹榕嘌提取的成骨细胞,突,胞浆丰富并向外伸展,伸出几个突起与临近细胞伸出的突起相连,有聚集天细胞铺满单层。长满瓶底时,细胞为梭形及立方块状,排列紧密,可见圆形或鳞片形细胞。随着培养时间的延长,成骨细胞可呈多层生长。
赴盍Σ舛ǎ禾ㄅ卫度旧ê螅度鞠赴K劳鱿赴0次幢焕度鞠赴所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活力的数据,本实验活细胞率%~活性染色:细胞钙钴法染色显示呈强阳性,细胞胞浆内可见灰、黑颗粒定位于酶活性之处,证明细胞内有活性谋泶铩逋饪蠡芰觳猓耗┐未ù南赴ぶ、芎笙赴矢床阕生长,中心部细胞密集可发生钙化