文档介绍：3温和噬菌体诱导和噬菌斑观察
温和噬菌体诱导和噬菌斑观察
一、教学目标及基本要求：
了解温和噬菌体的性质，学****溶源菌的检查方法。
掌握噬菌体效价测定方法
了解噬菌斑的形成过程。
二、实验原理
温和噬菌体侵染宿主细胞后将其基因组整合到宿主细胞的染色体组中，使宿主细菌成为溶源性细菌。溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具有感染力的噬菌体。可以用物理或化学的方法诱导，使其大部分或全部裂解。检测时需要有对此温和噬菌体敏感的宿主细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体，该细胞被称为敏感株。敏感株可以从待检的溶源株相近的种或变种中找到。
实验中选用携带X/dX噬菌体的大肠杆菌，称为双重溶源性菌株。该菌株同时被X完整噬菌体和X缺陷噬菌体(dA)侵染。该菌株一般用于高频转导，两种噬菌体中只有完整的X噬菌体才能在侵染敏感株后于固体平板上形成噬菌斑。每毫升噬菌体裂解液中所含的噬菌体数量被称为噬菌体效价，一般以每毫升噬菌体裂解液在含有敏感菌的固体平板上形成的噬菌斑的数量来表示。裂解量则是表示一个细胞被裂解后所释放出的噬菌体数量，可以根据每毫升裂解的溶源性菌株数量和效价进行计算。
三、实验材料
菌种：带有噬菌体X和缺陷噬菌体(X dgal+)的双重溶源菌(E. coli K12F2gal- / X dgal+/ A.)
敏感菌大肠杆菌(E. coli K12Sgal-)
培养基：肉汤固体培养基，肉汤液体培养基，肉汤半固体培养基(%琼脂)，加倍肉汤培养基(成分与肉汤培养基相同，但浓度加倍)(见附录H-1. 1)=
含镁磷酸缓冲液：磷酸二氢钾2g,磷酸氢二钾0. 7g,,蒸馅水 1000mlo
生理盐水，***仿。
其它：培养皿(®7. 5cm)，磁棒，磁力搅拌器，紫外照射箱，无菌移管，水浴锅等。
四、实验内容
噬菌体的诱导和裂解液的制备
（1）菌体培养
1） K12F2gal-/Xdgal+/X菌株斜面挑取1环接种于3ml肉汤培养基中，37°C振荡培养18h。
2）取1ml培养液接种于装有9ml肉汤液的150ml工角瓶中，37°C振荡培养4~6h。
（2）噬菌体的诱导和裂解液的制备
1）取10ml培养液，离心（3500r/min, 15min）收集菌体。菌体用10ml加镁磷酸缓冲液离心洗涤广2次，最后将菌体悬浮于3. 1ml加镁磷酸缓冲液中，制成细胞悬浮液。取 0. 1ml菌悬液用生理盐水稀释，参照细菌菌落总数测定方法检测菌悬液中的溶源菌数量（Nl）o
2）将其余3ml菌悬浮液放入675mm培养皿中，在诱变箱内以紫外线照射10s,然后加入3ml加倍肉汤培养液，于37°C避光培养2~3h。
3），参照细菌菌落总数测定方法检测菌裂解液中的残存的溶源菌数量（N2）。另取5nil经诱导的处理液移入离心管中，***仿剧烈震荡 30so