文档介绍：四川大学博士学位论文高效灭蝗基因工程菌的构建遗传学专业研究生:张杰指导教师:杨志荣首先利用启动子探针型载体pSUPV4直接在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌((Pseudomonas pseudoalcaligenes)基因启动子片段,获得具有强启动子的重组子 pPA7。对PA7片段的序列分析发现其距5'端931bp-1091bp处具有原核生物典型基因启动子的保守结构一10区和一35区,以及翻译必需的SD序列和翻译起始位点等。分别设计正向引物FPPAI. FPPA2,反向引物RPPA1, RPPA2对PA7片段进行PCR次克隆后定向连接到pSUPV4的多克隆位点区并保证阅读框不变,得到二个次克隆重组子卡那霉素抗性测定发现次克隆重组子的抗性相似,为600 u g/ml左右,证明pPA7-2所克隆的5’端899-1120bp片段在大肠杆菌中具有启动子的功能,5’端1120bp后的片段缺失对启动子没有影响。5’,推测该片段可能对启动子具有增强的作用。应用电穿孔转化法将pPA7转入类产碱假单胞菌,卡那霉素抗性测定发现龚过转化的类产碱假单胞菌卡那得素抗性明显高于未经转化的类产碱假单胞菌, 证明PA7片段在类产碱假单胞菌中具有启动子功能。对次克隆得到的重组子 pPA7-2以同样的方法进行验证,表明其在类产碱假单胞菌中也具有启动子功能。对PA7片段进行Southern杂交鉴定证明该片段来自于类产碱假单胞菌基因组且可能以单拷贝存在。克隆了类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因并对杀虫蛋白启动子及信号肤进行分析。将类产碱假单胞菌基因组DNA经Sau3A1部分酶切后,与BamHl酶切的 PUC19质粒连接并用于转化大肠杆菌DH5a。用根据纯化杀虫蛋白的N末端氨基酸序列测定结果,合成寡聚核昔酸探针,与所获得的重组菌落进行筛选,经两轮筛选得到5个阳性克隆,其中一个阳性克隆pSCI用于进一步鉴定。-Kpnl酶切片段含有杀虫蛋白基因,该片一—-一一-一--R)II)巡生}鱼些一一一一-一一—一段经测序分析证实存在一个较长的开放阅读框,可编码276个氨基酸残基构成的蛋白质。该基因的推测氨基酸序列包括22个氨基酸残基构成的信号肤序列和 254个氨基酸残基构成的成熟蛋自序列。22个氨基酸残基构成的肤序列位于成熟蛋白序列之前,其信号肤仅具有C末端区及不典型的N末端区和同时缺乏明显的疏水区(H-domain),与细菌素和信息素信号肚特征类似。该信号肤不能利用现存的生物信息学模型如SignalP进行运算预测。杀虫蛋白基因5’端侧翼区含有与大肠杆菌核糖体结合位点相似的Shine-Dalgam。序列,但未发现类似于大肠杆菌启动子一10区和一35区的序列。序列比较显示,类产碱假单胞菌杀虫蛋白与其它细菌***蛋白之间缺乏明显的同源性。通过生物信息学的方法将环状芽饱杆菌(Bacillus circulans)C-2 Chil几丁质酶序列及功能域进行分析,同时还利用二级结构预测(PHDsec)预测、通过SignalP 进行信号肤判断及剪切位点预测、das一跨膜预测,通过Swissmodel进行3D结构分析等生物信息方法对利用PA7启动子及杀虫蛋白基因启动子PSC的两种连接方式进行评估预测,两种连接方式基本上不会影响编码蛋白的空间结构,几丁质酶基因Chi 1的信号肤序列在革兰氏阴性菌中不会改变其性质及剪切位点。因此在理论上两种连接方式可行的。,在PCR扩增体系中添加DMSO, 克服扩增中两端引物的Tm值大的差别,成功扩增CH工、CSP, LQZ, PSC片段。以pLAFR3质粒为载体,在经过相同特异性酶切后获得与克隆片段酶切后匹配的粘性末端,构建重组质粒pLCHII, pLCHI2。以大肠杆菌HB 101(pRK2013)为辅助质粒,通过三亲转化的方法将经过四环素抗性筛选过的HB 101印LCHI 1), HB 101(pLCHI2)重组子的质粒导入类产碱假单胞菌。在含四环素以几丁质为唯一碳源的培养基上筛选出转化子PLCHI I , PLCHI2。转化子能将几丁质酶基因分泌到胞外。以转化子PLCHI I为模板,通过PCR反应扩增到LQZ, CSP片段; 以PLCHI2为模板,扩增到PSC, CHI片段。Southem杂交证明几丁质酶基因片段来自pCHII。 SDS-聚丙烯酞***凝胶电泳分析显示转化子均能产生约74KD的蛋白质带与 PCHI I一致。室内的蝗虫喂饲实验表明PLCHI2致死率达85,比出发类菌致死率68%有显著提高。关键词:类产碱假单胞菌,基因启动