文档介绍：上海交通大学硕士学位论文
人体肠道益生菌的分离鉴定抑菌和降脂功能研究
摘要
益生菌是来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物许多研究表
明益生菌主要是乳杆菌和双歧杆菌具有抑制病原微生物调节胃肠道健康
增强免疫应答预防癌症降血脂降血压抗突变和抗肿瘤等功能西方国家
对益生菌优良菌种的选育和功能的研究相对较多多种益生菌产品已投放市场
但也存在着技术性能不高机理不明安全性评价不够等问题欧洲最大的科学
家合作项目 PROEUHEALTH 旨在开发新型的微生态制剂以促进人体健康目
前正在进行中我国虽然也有益生菌产品问世对部分菌种的抑菌性能也进行了
研究但对于优良菌种的选育各种益生功能机理的研究技术性能和安全性能
评价等工作目前明显落后于欧洲我国以及亚洲地区面临着高胆固醇心脏病的严
重威胁降胆固醇功能的益生菌研究才刚刚起步筛选来源于人体的安全性高的
益生菌菌株并研究其潜在的抑菌和降胆固醇等功能对于开发新的益生菌产品促
进人类健康具有重要的现实意义和广阔的应用前景
本项研究从益生菌的筛选和分子鉴定出发针对来源于健康青年和儿童肠道
的乳杆菌和双歧杆菌一方面筛选具有高抑菌活性的菌株另一方面筛选具有降
胆固醇能力及耐受胃肠道低 pH 和胆汁盐性能的菌株并初步研究益生功能的机
理采用分子生物学的方法进行乳杆菌和双歧杆菌的筛选和鉴定相对传统微生
物学方法更快速便捷可以直接鉴定到种实验研究的乳杆菌和双歧杆菌来自于
健康人群肠道安全性能高于其他来源的益生菌
首先通过选择性培养基平板涂布法筛选得到若干乳杆菌和双歧杆菌经革兰
氏染色选出阳性且形态特征符合乳杆菌或双歧杆菌的菌株分别用乳杆菌和双歧
杆菌特异引物将分离得到的细菌总 DNA 进行 PCR扩增如得到 1500bp 左右双
歧杆菌特异片段或 500bp 左右乳杆菌特异片段即可进一步确认 RAPD 法用于
对初步筛选确认的菌株进行归类 S23 随机引物用于乳杆菌和双歧杆菌的归类具
有菌株特异性且结果可重复是理想的随机引物选择部分归类后的代表性菌
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株对其 16S rDNA PCR 产物进行 DNA 测序将测序结果进行序列分析并提交
GeneBank 获得序列号 ACCESSION NUMBER 从而鉴定到种用于进一步的
实验
研究表明双歧杆菌和乳杆菌均有许多抑菌效果明显的菌株 47 株实验菌株
中 15 株乳杆菌和 13 株双歧杆菌对蜡样芽孢杆菌有抑制作用 4 株乳杆菌对 3
种革兰氏阳性和 3 种革兰氏阴性指示菌均有抑制作用 L. salivarius LMa1 和 L.
gasseri LMa3 两株菌具有较高的广谱抑菌作用可以作为进一步研究益生菌抑
菌机理和其它益生活性的出发菌株有机酸乙酸和乳酸和细菌素类对热稳
定且对酸和部分蛋白酶敏感的两大类抑菌物质被确认为抑菌作用的基础在低
pH 条件下两类物质综合作用产生较强的抑菌效果低 pH 是表现抑菌活性的
必要条件只有当 pH 低于某一值本研究中为 时抑菌物质才能发挥作
用
研究证明益生菌具有去除培养基中胆固醇的能力 27 株实验菌株中 5 株对
培养基中胆固醇的去除率达到了 40 以上 12 株去除率介于 30 ~40 之间
其余 10 株去除率低于 30 去除率和去除效力两个指标同时用于考量菌株的去
除胆固醇能力胆固醇去除率超过 40 的 Bm29 LM1 Lp0333 Xc3 Zc1 这
5 株菌生长良好去除效力 1 也都达到了 20ìg/(ml*u)以上可作为有潜力的菌
株考虑不同菌株的耐胆汁盐能力有明显差异 27 株实验菌株中有 4 株受胆汁
盐抑制严重其余 23 株对 牛胆汁的迟滞时间不超过 2h 抑制不明显不
同菌株的耐酸能力差异明显 27 株实验菌株中共有 7 株经 120min 酸化后迟滞
时间低于 10h 其余 20 株经 120min 酸化后迟滞时间超过 10h 耐酸能力较差
本实验益生菌菌株中的降胆固醇能力对胆汁盐的耐受性和对酸的耐受性之间没
有发现明显相关性
菌株 Bm26 对胆汁盐和酸性的耐受性都相对较强且胆固醇去除率也达到
其对蜡样芽孢杆菌金黄色葡萄球菌和粪肠球菌 3 种革兰氏阳性菌的
抑制作用明显故可以作为起始菌株进行进一步的研究和应用
关键词: 益生菌乳杆菌双歧杆菌抑菌胆固醇胆汁盐
II
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SCREENING, IDENTIFICATION AND STUDY ON
ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND
CHOLESTEROL-LOWERING P