文档介绍：抗体生物素标记操作方法
一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体
浓度影响，对于10 mg/ml的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
一、试剂和器材：
1、标记反应溶液： pH PBS（ sodium chloride）
NaCI g ; N&HPO ; NaHPQ - ;加双蒸水 900mL 左右，用HCI/，最后定容为1000mL
2、 10mMNHS-dPEG 4-Biotin 配方： NHS-dPEG 4-Biotin （分子量为587 ），溶解于95 d超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。
NHS-PEG 4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200 nmol/L储备液： 20mg NHS-dPEG 4-Biotin 溶解于 170 dDMSO中，-20 °C稳定几个月。
由于NHS-PEG 4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将
NHS-PEG 4- EP管中，以实际称量的 NHS-PEG 4-Biotin按比率加入超纯水。
3、超滤管
⑴、Millipore 超滤管[ 10KD]:截留分子量10KD残留体积200 pl，蛋白回收率95%, 7500旳（允许的最大离心力14000%）离心10min。
⑵、Millipore 超滤管[ 50KD]:截留分子量50KD残留体积80 d，蛋白回收率94%，7500>g （允许的最大离心力14000Xg）离心5 min。
⑶、Amicon Ultra - 离心超滤管（Millipore ），效果更好，典型的最
终浓缩物体积：5-15ul。
二、抗体超滤处理
标记前需要应用截留分子量为 50kDa的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理
（如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量），以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。
具体操作步骤：
1、于超滤柱中加入200卩l标记反应溶液，加入500ug单克隆抗体，混匀。
2、 4 °C，6000rpm,离心 2min。弃滤液。
3、于超滤柱中加入100卩l标记反应溶液，混匀。4C, Max14000>g, 2min。
4、重复步骤2 6到7次。
5、混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置 1mi n。
6、将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4C, 1000旳，2min,收集滤液。
7、取50卩l PBS于超滤柱中混匀，静置1min。
8、倒置超滤柱，4C, 6000rpm, 2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，
4 C放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到 2mg/ml （）。
三、生物素标记抗体
1、计算抗体标记需要生物素用量。
抗体浓度2 mg/ml