文档介绍：实验二叶
、质粒DNA的提取
质粒DNA勺提取、酶切与鉴定
［原理］分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
本实验采用碱变性法抽提质粒DNA,是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
［试剂］
.溶液I:
50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-;用前加溶菌酶4mg/ml。
.溶液II:
200mmol/LNaOH、1%SDS。
.溶液III:
（60ml5mol/L醋酸钾、、）
.
.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20g/mlRNaseA。
.苯酚：氯仿（1:1,v/v）:酚需在160c重蒸，加入抗氧化剂8-羟基唾咻，%,并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24:1（v/v）0
［器材］
-16型台式高速离心机
215ml塑料离心管
.离心管架
.微量移液器
.常用玻璃器皿
［操作步骤］
.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100仙g/ml氨苇青霉素的1XLB中，37c培养过夜。
.，10000r/min离心lmin,去掉上精液。加入150仙l溶液I,充分混匀，在室温下放置10min。
.加入200口新配制的溶液II,加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。
.加入150口冰冷的溶液III,加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。
.用台式高速离心机，10000r/min离心5min,将上精液移入干净的离心管中。
.向上精液中加入等体积酚/氯仿（1:1,v/v）,振荡混匀，转速10000r/min,离心2min,将上精液转移至新的离心管中。
.向上精液加5mol/,混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min,离心5min,倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
.%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。
.加入50/含RNaseA20仙g/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20C备用。
二、质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定
［原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物