文档介绍：实验二总RNA 提取、 RT- PCR 制备 cDNA 及DNA 克隆 Total RNA Preparation,cDNA preparation by RT- PCR,and DNA cloning ?实验二和实验三是以获取纯化的表达蛋白质为目的,从 RNA 提取开始,经过 RT-PCR 获取特定基因的 cDNA 片断,再进行重组、筛选获取克隆,最后进行基因编码蛋白质的表达、纯化、和检测。第一天 RNA 的提取; 2. RNA 含量测定; 3. RT-PCR RNA 及 PCR 产物; 2. RT-PCR 产物的纯化; 3. PCR 产物的快速酶切; PCR 酶切产物的乙醇沉淀纯化; PCR 酶切状况, DNA 浓度的微量测定; ; RNA Total RNA isolation from tissues by One- Step RNA Purification Method 1、取小鼠,断颈处死,用剪刀沿小鼠枕骨断开小鼠颈椎,露出枕骨大孔,然后从枕骨大孔分别向两侧剪开小鼠颅骨,用镊子小心向上掰开顶骨,取出暴露的大脑。(取出肝脏-20 ℃冻存) 实验步骤: 第一天 2、玻璃匀浆器中加入 4ml 的 RNAiso 试剂置冰上待用。 3、立即取出脑组织,移入玻璃匀浆器中,立即在冰浴中上下研磨十次左右进行匀浆。 4、然后将匀浆液平均转移入 4只 2ml 离心管中, 室温静置 5分钟。第一天 5、加入 ***仿,盖紧管口,用力颠倒离心管 3-5 次进行混合,室温再静置 5min 后。 6、 12000rpm 4℃离心 10min ;用移液器将上层水相分别转移入 离心管,每只 600 μL。 7、加入 600 μL异丙醇,颠倒混匀后室温静置 5-10min , 15000rpm 离心 5min 。第一天 ,加入 1mL DEPC 处理过的 75% 乙醇,振荡片刻,再于 15000rpm 离心 5min ;再次去净上清,敞口室温静置 5-15min ,待 RNA 沉淀略干。 DEPC 处理过的蒸馏水 100 μL 溶解 RNA ,4℃保存备用。第一天 RNA 含量的紫外分光光度计测定 Determination of RNA contents by UV- Spectrometer ?操作:取两只比色杯,一只加入 1470 μL DEPC 处理过的蒸馏水,再加入 30 μ L RNA 液;一只加入 DEPC 处理过的蒸馏水?混匀后置紫外分光光度计中,分别测定其在 260nm 和 280nm 的光吸收值,计算出二者的比值与 RNA 溶液浓度。第一天