文档介绍：血清谷丙转氨酶活性的测定一、实验目的一、实验目的 1. 。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2. 。熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3. 。了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。二、基本原理血清中的谷-丙转氨酶( ALT ),在 37℃、的条件下,可催化基质(底物)液中的丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸: 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的 2,4 二硝基苯肼发生加成反应,生成丙酮酸-2,4- 二硝基苯腙,进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物, 其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量,亦即与 ALT 活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较,便可算出或通过标准曲线查出血清中 ALT 的活性。*仪器 1. 5 × 15cm 试管、刻度吸量管。 2. 恒温水浴、离心机、 721 型分光光度计。*试剂磷酸盐缓冲液⑴ 磷酸氢二钠溶液:称取 Na 2 HPO 或 Na 2 HPO 4·2H 2 溶解于蒸馏水中,并稀释至 1 000ml,4 ℃保存。⑵ 磷酸二氢钾溶液:称 KH 2 PO 溶解 dH 2O中,稀释至 1000ml, 4 ℃保存。⑶将磷酸氢二钠溶液 420ml 和磷酸二氢钾溶液 80ml 混和即为的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴, 4℃保存。三、仪器与试剂 2. 标准丙酮酸(含丙酮酸 μ mol/mL ) 取标准丙酮酸钠 10mg ,用上述缓冲液准确定容为 50 mL 。此液须当日用当日配。 3. ALT 底物液(含α-酮戊二酸 2μ mol/ml 及 DL- 丙氨酸 200 μ mol/ml ) 取α-酮戊二酸 , DL- 丙氨酸 7g , 用试剂 1溶成 100ml ,在稀释到刻度前,以 1mol /L NaOH 调 pH 至 (因为转氨酶在以下或以上的环境中酶活性下降),加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用 4天。 4. 二硝基苯肼溶液取分析纯 2,4 二硝基苯肼 ,用 1mol /L HCl 溶于 100ml ,置棕色瓶中保存。 5. NaOH 溶液常规配制。 1、血清样品制备取鸡血 100mL 于4 oC静置 10hr ,后经离心分离得到血清, 保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中高,故应防止溶血;若血清中此酶活性过高,则可适当稀释后再用) 。 2、标准曲线制作取6支干燥洁净的试管,按下表操作,得出实验结果。以吸光度值为纵坐标,酶活力单位数为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。四、实验操作 3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定取4支干燥洁净试管,按下表操作(血清和底物溶液事先保温 10min ): 五、实验结果 1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性 2、计算: 丙酮酸物质的量( μmol ) SGPT 活性单位/100mL= ×1000 时间( min )