文档介绍：实用标准文案
使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上
转录反应步骤和孵育
解冻冷冻的试剂
把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在
-20。
vortex10×react5’端加帽的转录的
增加。注意GTP的CAP模拟物为4:1时提供了一个很好的
RNA产量和加帽效率的平衡。没有
加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。
这些未加帽的转录很可能迅速
的被卵母细胞降解。
除了加入不同比率的
m7G(5')ppp(5')G，T7-mMESSAGEmMACHINE反应在标准条件下进行。
使用1ug的T7球蛋白模板DNA37度孵育
1h。球蛋白RNA(6μg/mL)在25ul的ReticLysate
IVT?进行翻译，加入
[35S]
蛋氨酸(1200Ci/mmol)
，30°C反应60min。
测量TCA-可沉淀cpm的量。
精彩文档
实用标准文案
彻底混匀
轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。
37度孵育1hr
一般来说，孵育1h后可获得
80％合成。对于最大化合成，建议孵育
2h。由于SP6反应稍微
慢于T3和
T7反应，它们尤其可能受益于第
2h的孵育。
对于合成《300base的转录和转录效率低下的模板，建议第二个小时的孵育。
如果反应是示踪标记：孵育后（
TURBODNase处理前或处理后），通过
TCA共沉淀可等分的
放射性标记示踪反应来评价产量
(seestep5.,
“Quantitationbytraceradiolabeling
”
onpage14)

加入1ulTURBODNase，37℃孵育15min。
DNase处理可清除模板DNA，对一些应用来说并不必要，因为相对于
RNA来说，模板DNA的
浓度非常低。
,混匀
℃孵育15min
RNA的回收
转录反应后所需要的净化程度取决于RNA的用途。以下是四种不同的方法，根据你的用途选择一种或多种。
? Kit
此试剂盒专为体外转录合成高产量的 RNA的纯化所设计。快速、简单的去除 RNA中的核苷酸、
短的寡核苷酸、蛋白。回收的 RNA可用于任何需要高纯度 RNA的实验。
2.***化锂沉淀
***化锂沉淀法是一种简单有效的可除去未合成的核苷酸和大部分蛋白质。
但它并不沉淀转移
的RNA，也不沉淀小于300核苷酸的RNA。同时，为了保证沉淀效率，
μg/μL。mMESSAGEmMACHINE?反应获得的RNA产量相对较低，下面第一步加
LiCL沉淀液
之前不用水稀释转录产物
-free
水、30ulLiCL沉淀液，终止反应，沉淀
RNA。
，-20℃冷却30min。
℃最大速度离心15mintopelletRN