文档介绍：实验六碱法提取质粒
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一．目的
二．原理
附：原理示意图
三．试剂
四．器材
五．注意事项
六．操作步骤 1
六．操作步骤 2
六．操作步骤 3
GFP back
10 mmol/L Tris·Cl ()1 mmol/L EDTA ()
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50×TAE
242g Tris 碱
冰乙酸
100ml EDTA (pH )
1×TAE
mol/L Tris-乙酸
mol/L EDTA (pH )
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四．器材
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 离心机
4. 电泳仪和电泳槽
5. 玻璃器皿与耗材
量筒、三角瓶、平皿;
EP管(, );
枪头(1ml, , 10μl);
牛皮纸、纱布、牙签等
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五．操作步骤 1
挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3ml LB培养液中，37℃振荡培养14~16小时。
ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。
加入500μl~1ml STE buffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。
加入预冷的溶液I 100μl，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟 (重悬细胞)。
加入200μl溶液Ⅱ(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴 (碱变性染色体DNA、蛋白质)。
在5分钟内，加入溶液III 150μl，轻柔颠倒5~10次，冰浴10分钟（利用pH差异，复性质粒DNA）
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五．操作步骤 2
12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA，及不溶的变性蛋白，取上清。
上清液用Tris-HCl饱和苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次剧烈振荡20秒，12,000rpm 离心5分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为蛋白层，下层为酚层。
上清液用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm离心10分钟。
上清液加入1/10体积 3M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置10-15分钟。
在12,000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。返回目录
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五．操作步骤 3
去上清，加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。
12,000rpm 离心10分钟。
去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。
加入30~50μl ddH2O或TE（pH ），溶解质粒。
加入RNaseA使终浓度为20μg/ml，室温放置30分钟~1小时。
1%琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA纯度及浓度。
取1-5μl DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入分光光度计的石英比色杯中，测定 OD260及OD280，并计算OD260/ OD280比值和DNA浓度：

DNA浓度= OD260×稀释倍数×50/1000 （ μg / μl ）
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分次收集4ml菌液离心，留沉淀
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五．操作步骤 4
琼脂糖（1%）凝胶电泳
称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入1×TAE，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；
溶液冷至60 ℃，加入 µg/ml，混匀，注意戴手套操作；
将琼脂糖倒入电泳板中，-，迅速插上梳子，检查有无气泡；
待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入1×TAE电泳buffer，让液面高出胶面1mm；
在DNA样品中加入1/6 loading buffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm （长度以两个电极之间的距离计算）；
根据指示剂的位置，判断是否终止电泳。
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pGFP pBSK M
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六．注意事项
为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：
加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；
加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次) ，使蛋白质和核酸变性；
加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5~10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。
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周四：