文档介绍:生物化学与分子生物学设计实验
(胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一脂
法测定血清尿素)
小组成员:
班级:麻醉1L2班
日期:2012年12月19
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一脂法
测定血清尿素
实验目生物化学与分子生物学设计实验
(胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一脂
法测定血清尿素)
小组成员:
班级:麻醉1L2班
日期:2012年12月19
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一脂法
测定血清尿素
实验目的
1、 掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。
2、 学习用比色法测定血清尿素。
3、 巩固有关胆固醇和尿素的知识。
4、 进一步熟练UV2100型分光光度计的
重点、难点:
重点:1、氧化酶法测定总胆固醇的原理
2、二乙酰一月亏法测定血清尿素的注意事项 难点:氧化酶法测定总胆固醇的原理
一、 实验原理
氧化酶法测定血清总胆固醇
血清总胆固醇(TC)包括:游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是 胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。
第一步:血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸 (FFA) o
第二步:胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成A4-胆邕烯酮和H2O2o
第三步:H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时,经过氧化物酶催化,反应生 成苯醍亚胺非那月宗的红色醍类化合物,其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。
二乙酰一脂法测定血清尿素
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4, 5-二甲基-2-氧咪哩化合物,颜 色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定,故由试剂中二乙酰一月亏与强酸作用 产生二乙酰。
二、 操作步骤
(一)氧化酶法测定血清总胆固醇
终点法检测TC,取试管3支按下表依次加样。
酶法测定TC操作步骤
加入物(U1)
空白管
标准管
测定管
血清
一
一
20
标准液或定值血清
一
20
一
蒸馅水
20
一
一
酶试剂
1 000
1 000
1 000
混匀后,37T保温10 min,每管加3ml水混匀,用分光光度计比色,于500 nm波长处以空白管调零,读出各管吸光度。
(二)二乙酰一脂法测定血清尿素
取试管3支,按下表依次加样。
二乙酰一月亏法操作步骤
加入物(ml)
空白管
标准管
测定管
血清
一
一
尿素标准应用液
一
一
蒸馅水
一
一
二乙酰一月亏溶液
酸性试剂
混匀,置沸水浴加热12min,取出置冷水中冷却5min,以空白管调零,在 540nm处读取各管吸光度。
三、注意事项
(-)氧化酶法测定血清总胆固醇
1、 最后加酶试剂,各管反应时间应一致;
2、 比色应在30min内完成;
3、 试管在操作前尽量保持干燥;
4、 试剂中酶的质量影响测定结果;
5、若需检测游离胆固醇浓度,将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。
(二)二乙酰一脂法测定血清尿素
1、试剂中加入氨基硫月尿和镉离子,可增进显色强度和色泽稳定性,但仍有轻度
褪色现象,(每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后,应及时比色。