文档介绍：实验二质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳11. 实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。22. 相关基础知识限制性核酸内切酶:是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。31) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶,它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。42)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:Ⅰ型Ⅱ型*Ⅲ型5第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。6第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:7粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为:5’…… G ‘AATTC ……3’ 3’…… C TTAA ‘G …… 5’从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序(palindrome)。_和‘表示在双链上交错切割的位置,切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段,各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 8II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是:5’…… GAT ‘ATC …… 3’3’…… CTA ‘TAG …… 5’切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端:9第三类(III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。10