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PCR - 从实验建立到完成回收
新手指南 P行优化，具体需要优化的项目为：PCR 小提示：PCR反应要与PCR
分析在各自独立的区域完
反应缓冲液中的引物浓度和Mg2+ 浓度，及反应的退火温度。此外，加入添加物以提高DNA聚合 成，以确保PCR反应所用
的试剂不会被PCR产物污
酶稳定性及持续合成能力、或者加入添加物以提高杂交严格性，或者采用能降低“引物——模 染。相应的，PCR产物分析
板”非特异性反应的策略，这些方法都能改善PCR反应的效率。使用高纯度试剂对于PCR反应的 所用的移液器也不能用于
PCR反应。
成功来说也很重要，特别是在扩增稀有模板（如基因组DNA上的单拷贝基因、或者被感染生物体
基因组DNA上的致病病毒DNA等）时。
加入对照反应对于监控PCR反应的成功十分重要。任何时候，只要可能，都要加入阳性对照，这
可以检测PCR反应条件能否成功的扩增目标序列。由于PCR反应非常敏感，只要有很少的拷贝就
能进行扩增，因此需要加入一个不含模板DNA序列的阴性对照，以确保PCR反应所用的试剂没有
被模板DNA污染。
引物退火特异性和PCR缓冲液
在PCR反应中，退火发生在引物及其互补的DNA模板序列之间。引物的特异性退火是扩增反应成
功的必要条件。为了在短的退火时间内充分杂交，需要使用高浓度的引物，但是这样，引物在退
火过程中也会与非特异性序列结合。非特异性退火的扩增产物与特异性扩增产物产生竞争从而会
极大的降低特异性产物的产量。
成功的PCR实验很大程度上取决于引物特异性结合产物相对非特异性结合产物的比例系数是否足
够高。退火过程主要受到PCR缓冲液中的各种组分（特别是各种离子条件）和退火温度的影响。
特定的阳离子组合在一起能够帮助引物在更广泛的退火温度范围内保持退火特异性。这样就不再
需要针对每一对“引物—模板”系统进行退火温度的优化，而且允许不同退火温度的引物同时在
非理想条件进行PCR扩增实验。
BRO PCR初学者提示05/2013 Sample & Assay Technologies 3均衡的离子组合促进了引物的特异性退火
常用的PCR缓冲液通过阳离子与DNA主链上带负电的磷酸基团结合，中
和这些负电荷。这削弱了DNA模板和引物分子之间的电性排斥作用，增
强了引物杂交的稳定性。大多数市售的PCR缓冲液中仅含有单价的K+离
子，它不仅使引物特异性物退火更稳定，同时却也增强了引物非特异性
退火的稳定性。这往往引发弥散的和非特异性的DNA扩增，从而导致产