文档介绍：高效液相色谱方法及应用
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色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的种：直接注射进样、停流进样和高压六通阀进样。
直接注射进样的优点是操作简便，并可获得较高的柱效，但这种方法不能承受高压。
停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。这种进样方式操作不方便，重现性差，仅在不得已时才使用。
高压六通阀进样的优点是进样量的可变范围大、耐高压、易于自动化，但容易造成谱峰柱前扩宽。
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色谱柱
多用内壁抛光的不锈钢制成，内径2～6mm，直形柱柱长l0～l00cm。
在需要增加柱长时，可使用死体积小的连接管，把几根直形柱串接起来。
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检测器
用于液相色谱中的检测器，应具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，还应该对温度和流速的变化不敏感。
液相色谱法中有两种基本类型的检测器：
一类是选择性检测器，如紫外一可见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折光检测器。
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(1)紫外一可见分光光度检测器。
是一种应用广泛，灵敏度和测量精度都比较高约选择性检测器。
它的检测原理基于被测组分对特定波长的紫外一可见光的选择性吸收，被测组分浓度与吸光度的关系服从朗伯一比尔定律。
它适用于在紫外和可见区有吸收的样品。
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(2)示差折光检测器。
示差折光检测器是根据流动相中出现组分时，流动相折射率发生变化而设计的。
溶液的折射率等于流动相折射率与其浓度的乘积，加上组分折射率与其浓度的乘积。
示差折光检测器为通用型检测器，凡具有与流动相折射率不同的组分，均可检测且操作简便，但这种检测器灵敏度不高，对温度十分敏感，不能做梯度淋洗。
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建立高效液相色谱分析方法的一般步骤
通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：
①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。
④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
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下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用：
使用HPLC级试剂和流动相
清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤
保证溶剂的相溶性
如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染
对仪器的使用、维护和保养进行记录
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高效液相色谱的应用
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一、 医药方面
1、分离分析药物的组合含量
由于一种药剂常含有多组分，色谱方法是既能分离又能定量的方法。如脂溶性维生素片，含有各维生素，用C18柱及含1%碳酸铵的甲醇为流动相。一次即可将各维生素B6、D1、A、E同时分离并定出含量。又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。
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2、药物生产中进行中间控制
生产抗菌素时，首先要了解发酵液中的主体与副产物的存在情况。例如：青霉素、四环素、头孢子菌素、红霉素、庆大霉素等的发酵产物，均可用C18柱和甲醇及缓冲液配制的流动相或用离子对法，分析主体及其副产物的含量。对普鲁卡因酰***、茶碱等可进行主体含量的测定，对***甘油可测定主体含量及其降解产物，以便保证药物的热量。
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3、分析药物在体内的残量：
这是近来研究新药效能很主要的内容之一，如磺***类药品在血清及尿中含量也不允许太大，可用C18柱及酸性乙醇为流动相，测定含量后，则可估计最合适的用药剂量。
4、测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢产物在血清中存在的情况。如测血清中的***酸及戊二酸。测尿中代谢产物更为方便，不需要繁锁的预处理。因为研究尿中的组分能鉴别病人的代谢功能，对病理研究或临床诊断均具有重要的参考价值。
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二、生化方面
主要方向是分析嘌呤、嘧啶基的核苷或核苷酸及具有相应的肽和蛋白质。
①在细胞核中有种类繁多的核苷酸，可用不同的检测器或酶转移检测器或利用酶反应进行定性测定。用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。C18柱用含磷酸的缓冲