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Q-PCR实验流程
①实验前准备，每
将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性；
在该PCR管中加入下列试剂（Promega）
oligo（dT）
Random primer
10mM dNTP
RNase inhibitor
5 x buffer
M-MLV
µl
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
µl
将上述20μl反应溶液30℃保温10min；
42℃保温50min；
85℃保温10min；
-20℃保存。
2. microRNA：
使用茎环逆转录法，原理如下图：
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在去RNase的PCR管中配置以下溶液.
total RNA
X个miR逆转录引物
H2O
*X
µg
µl
总体积
µl
2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；
在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega)
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer
M-MLV (promega)
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
µl
将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min；
42℃孵育50min；
85℃孵育10min灭活逆转录酶。
四、定量PCR检测
：
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。
2．确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（
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