文档介绍：实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法
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实验一存在问题
1、香柏油要加适量
2、涂完菌后接种环一定要灼烧灭菌
3、无菌操作
4、擦镜纸浪费
5、载玻片要洗干净
6、画图不符合要求
第二页，讲稿共二十五页
游离芽孢
末端芽孢
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（二）实验原理——芽孢染色法原理
芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；
但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢；
进入菌体的染料经水洗后可被脱色；
当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。
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1、活材料：
革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli）
芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）
2、染色液和试剂：
革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红；
芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、%蕃红水溶液 ；
二甲苯、香柏油 。
3、器材：
载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
（三）实验器材
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（1）涂片 载玻片1张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。
（2）干燥 室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。
（3）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。
（四）实验步骤——革兰氏染色
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（1）初染 结 晶 紫 2min 细水冲洗 甩去积水
（2）媒染 卢戈碘液 1min 细水冲洗 甩去积水
（3）脱色 95%乙醇 20-30s 细水冲洗 甩去积水
（4）复染 番红 3min 细水冲洗 甩去积水
（四）实验步骤——革兰氏染色
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待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜下检查。
革兰阳性菌（G+），
被染成蓝紫色。
革兰阴性菌（G-），
被染成红色。
（四）实验步骤——革兰氏染色
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实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤）
涂片
蒸馏水
涂片
结晶紫
碘 液
95%乙醇
自然干燥
媒染1min
脱色20~30s
初染1min、后水洗
固定
番红
复染2min
干燥 镜检
水洗时不要直接冲菌膜
水洗
水洗
水洗
每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。
2分钟
1分钟
3分钟
干燥固定
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取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜） →→自然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，2min） →→水洗→→媒染（碘液，1min） →→水洗→→脱色（乙醇，20-30s） →→水洗→→复染（蕃红，3min） →→水洗→→自然干燥→→观察。
（四）实验步骤——革兰氏染色
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涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄；
酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，要求脱至流出的乙醇不带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
革兰氏染色注意事项
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制备菌悬液
染色
涂片固定
脱色
复染
镜检
改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
（四）实验步骤——芽孢染色
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芽孢染色---制备菌悬液
生理盐水
1、滴生理盐水
挑取2-3环菌苔
与生理盐水混匀
2、制备菌悬液
在EP管中滴2
滴生理盐水
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芽孢染色---染色
5%孔雀绿染液
1、滴加孔雀绿染液
沸水浴加热
15-20min
2、加热染色
在离心管中滴2-3
滴孔雀绿染液
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芽孢染色---涂片固定
经孔雀绿染
色细菌悬液
1、滴菌悬液
用接种环
均匀涂布
2、涂片
接种环取菌悬液
在载玻片中央
3、干燥
室温自然晾干
4、固定
通过酒精灯
火焰3次固定
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芽孢染色---复 染
%番红水溶液
1、滴番红水溶液
滴加数滴番红染液在菌膜