文档介绍：流式细胞仪简介和使用方法
第一部分
流式细胞仪标本准备
染色的一般原则及方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。
根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。
可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2m小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；
%胰酶、%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬， 37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。
细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。
准备单细胞悬液
：
%r EDTA,pH
% 的胰酶
10%血清的培养液
：
a. PBS洗涤细胞；
b. %有胰酶，37ºC处理2~8分钟；
c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。
d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。
样本处理
抗体染色一般方法
外周血白细胞分析：100ul全血
血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）
红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）
骨髓：100ul
其他样本，计数后决定使用体积
目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
细胞计数方法
传统手工计数：耗时、准确度差
流式细胞仪计数：
BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，？
partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度
反应体积
样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
抗体染色
最为普通的抗体染色原则：
1×106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态
精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度
SPECIFIC
ANTIBODY
NON-SPECIFIC
ANTIBODY
CONCENTRATION
AMOUNT BOUND
抗体滴定原理
流式细胞仪抗体滴定方法
3
3 µg
s/n =
1 µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
auto
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Dilution
Signal to Noise
TITER
孵育、溶血、固定
抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）
溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）
样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间
白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：
1，100ul外周血，加入100ul溶血剂
2，混匀后，室温下孵育10分钟
3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟
4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬
优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握
各溶血剂性能比较
抗体标记荧光素及其他荧光染料
荧光激发及发射原理
能量级
激发
激发态
发射
激光
能量损失
标记抗体常用荧光素 FITC
激发光：488nm 发射光：525nm;使用面最广，价格便宜
Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱
PE
激发光488nm 发射光575nm
此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强
检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素
价格较FITC昂贵
PE-Cy5 TC
激发光488nm, 发射光667nm
为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强
FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析
PE-Cy7
激发光488nm，发射光767nm
为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳
与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小
APC
激发光633nm，发射光660
在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。
核酸染料
细胞膜电