文档介绍：多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同.
DNA 引物
引物的选择遵从简单的规则:引物长度为 18-24bp 或更长, GC 含量为 35%-60% ,退火温度 55 ℃-58 ℃或更高。长些的引物(如 DMD 基因的引物, 28-30bp )使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。使用软件 Primers ( 从 ftp:/// 下载的免费软件) 来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使用 BLAST 工具在 NCBI 序列数据库中对多对引物进行比对,以检测可能的重复序列。
单基因的 PCR.
首先设计了一个分别单独扩增所有基因的 PCR 程序。反应混合物包括: 1xPCR 缓冲液, μ M 引物, 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶,共 25 μ L 反应体积。将在同一台 PCR 仪,在同型号的不同 PCR 仪上,在不同型号 PCR 仪上及在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果进行比较。在同一台 PCR 仪上或在同型号的不同 PCR 仪上扩增,实验的重复性很好,但在不同制造商的 PCR 仪上进行的扩增反应结果有明显差异,但是通过对循环条件的调节可以得到好的重复性。实验表明对于 100-300bp 的基因扩增产物,通过降低延伸温度可以增加某些产物的产量。对于单一 PCR 反应,退火时间与延伸时间并不明显影响结果,但改变退火温度可以改变 PCR 产物的特异性和产量。对于扩增 22Y 特异基因(Figure 2a) , PCR 程序 A 得到最佳结果(Table 2) 。
多重PCR
多重 PCR :等物质量的引物混合物(步骤 4 ) .
将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因要求对某些反应参数进行改变或优化(Table 1 和 Figure 2b) 。初次进行多重反应时,各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。结果将会揭示哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变。下面将解释并讨论一些优化的例子,由于许多参数被提及不止一次,因此这些例子并未严格遵照 Figure 1 中所列的步骤。
多重 PCR反应循环条件的优化编辑本段回目录
延伸温度. Figure 2c 展示了当加入相等量( μM each) 的四种用于扩增 Y 染色体上不同基因的引物进行多重 PCR 时,用程序 A 和程序 B 扩增得到的结果(Table 2) ,程序 B 有更高的延伸温度(72 ℃) 和更长的退火和延伸时间。总的来说,用程序 A 对 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的扩增得到了更高产量的 PCR 产物。此外,用程序 B 扩增时某些产物消失(Y-1 、 Y-2) ,同时出现了某些非特异性的扩增产物(Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的结果更差一些,表明高的延伸温度减少了某些基因的扩增,尽管我们试图用长的退火时间和延伸时间来消除这种影响。
延伸时间. 在多重 PCR 中,由于同时扩增多个基因,酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因素,就需要更多的时间来完成所有产物的合成。两个实验表明了延伸时间的影响。