文档介绍：半薄超薄切片技术
取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上
滴上预冷的固定液
用刀片将组织切下并修小
用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小果实,电子束照射下稳定
图像对比度较弱
Araldite
聚合均匀，收缩量很小，超薄切片可直接沾在没有支持膜的载网上，电子束照射下十分稳定，用重金属染色时易着色。
◆环氧树脂(epoxy  resin)
◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂
LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。
适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。
包埋操作中的注意事项
§所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；
§所用器皿应烘干；
§配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；
§包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；
§盛放过包埋剂的容器要及时用***清洗干净.
§皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；
5 超薄切片
削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，～。
超薄切片
   
超薄切片机：LEICA ULTRACUT R
超薄切片厚度:
<100nm,一般 50-70nm
载网和支持膜
载网(超薄)
载网
铜网
(常用)
不锈钢网
镍网
(免疫电镜)
直径：2-3mm，厚度：-
载网和支持膜
(2) 载网支持膜
膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击.
支持膜的种类:
火棉胶膜
聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)
碳膜
膜的厚度:10nm～20nm
6 超薄切片的染色
目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度.
常用染色剂: 重金属盐
各种染料
常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。
染色方法：
(1) 组织块染色
在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。
▲超薄切片染色
(2)超薄切片后染色
醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染
铀染:细胞核及结缔组织染色
铅染:提高细胞质成分的反差
1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积）
3%戊二醛 in PBS ,，室温5-6h，后4°C保存
2）漂洗： PBS 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3）后固定
1%锇酸固定 in PBS，4°C overnight
4）漂洗： PBS 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）
用***置换乙醇：
乙醇:***=1:1，纯***2次，每级20-30分钟
6）渗透
***:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight），1:2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！）
7）包埋聚合 60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，%戊二醛+%多聚甲醛 in PBS Ph
超薄切片图片
二、半薄切片技术介绍
半薄切片主要步骤
★取材
★固定
★漂洗、脱水
★渗透、包埋
★半薄切片
★半薄切片染色
每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败
FAA固定液
（福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切片
※一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。
※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；
※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。
卡诺固定液
1
2
纯酒精
15ml
30ml
***仿
5ml
冰醋酸
5ml
1ml
渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天
切片厚度：~5um
切片捞到载玻片上
半薄切片
▲半薄切片染色
染色方法
现象
番红－固绿对染法
木质化的细胞壁及细胞核－红
纤维素的细