文档介绍：流式细胞仪简介和使用方法
注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度90%处于过饱合状态
精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度
SPECIFIC
ANTIBODY
NON-SPECIFIC
ANTIBODY
CONCENTRATION
AMOUNT BOUND
抗体滴定原理
流式细胞仪抗体滴定方法
3
3 µg
s/n =
1 µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
µg
s/n =
auto
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Dilution
Signal to Noise
TITER
孵育、溶血、固定
抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）
溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）
样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间
白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：
1，100ul外周血，加入100ul溶血剂
2，混匀后，室温下孵育10分钟
3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟
4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬
优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握
各溶血剂性能比较
抗体标记荧光素及其他荧光染料
荧光激发及发射原理
能量级
激发
激发态
发射
激光
能量损失
标记抗体常用荧光素 FITC
激发光：488nm 发射光：525nm;使用面最广，价格便宜
Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱
PE
激发光488nm 发射光575nm
此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强
检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素
价格较FITC昂贵
PE-Cy5 TC
激发光488nm, 发射光667nm
为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强
FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析
PE-Cy7
激发光488nm，发射光767nm
为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳
与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小
APC
激发光633nm，发射光660
在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。
核酸染料
细胞膜电位、离子、脂类探针
现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。
详细信息，见细胞探针公司网站：

与流式细胞仪相关的荧光术语
MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度
自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低
流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内
第二部分
流式细胞仪使用一般方法及技巧
上机检测
样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测
打开流式细胞仪：预热及进行质控程序
选择相应的方案或新建方案
加载或重新调节各参数
上样检测
技巧一：定位目标细胞群体
寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。
使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群
如标本中无明显特征细胞群，可使用已建