文档介绍：浙江大学生物化学实验甲甲-质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定
（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定
5、操作步骤
⑴、质粒的提取
质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。
⑵、电泳鉴定
胶浓度：%
各步操作方法及注意事项解说详浙江大学生物化学实验甲甲-质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定
（一）质粒DNA的提取与电泳鉴定
5、操作步骤
⑴、质粒的提取
质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。
⑵、电泳鉴定
胶浓度：%
各步操作方法及注意事项解说详见P148。
6、实验结果及处理
仔细观察纯化过程中各步试验现象。
仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
1、限制性内切酶简介
限制性内切酶或限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease）是指能辨认双链DNA分子中的特异碱基序列，并在此序列处以内切方式将DNA双链同时切断的一类酶。
根据它们的作用特点，可将其分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，Ⅰ类酶由于切割位点随机，Ⅲ类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
Ⅱ类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是Ⅱ类酶中的限制性核酸内切酶。
限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，。现已发现近几百种(498种)。
该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序列处切断DNA双链。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个~6个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。
限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如：
⑴、产生粘末端的酶
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
BamHⅠ：G G A T C C HindⅢ：A A G C T T
C C T A G G T T C G A A
两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一个对称轴排列。
⑵、产生平末端的酶：
HaeⅢ：G G C C
C C G G
两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。
2、质粒pUC312的酶切图谱
质粒pUC312的酶切图谱见图2。
⑴、由图可见，实验所用的HindⅢ在质粒pUC312上为双切点的限制性内切酶， pUC312经HindⅢ酶切割后可产生大小二片段，，小片段为312bp。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
如为完全酶切，电泳后应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取的质粒进行鉴定。
⑵、而BamHⅠ在质粒pUC312上为单切点的限制性内切酶， pUC312经BamHⅠ，如为完全酶切，，由此可进一步对提取的质粒进行鉴定。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
3、酶切反应标准体系的建立
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
4、影响限制性酶切反应的因素
DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响酶的活性。
为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管头。
应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再用高盐浓度的限制酶水解。
（二）、质粒DNA的酶切鉴定
也可在第一个酶切反应完成后，将第一个酶变性除去后再进行第二个酶切反应。
3、操作方法
1、 HindⅢ酶 DNA切酶反应的操作
⑴ 向一无菌Eppendorf管中加入
ddH2O 8ul
10×buffer 2ul
重组质粒DNA（pUC312） 8ul（约1ug)
HindⅢ酶 2ul
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