文档介绍：浙江大学生物化学丙实验报告1

实验报告
课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________
实验名称：蔗糖酶的提取同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；制冰机；－20℃冰箱。
五、操作方法和实验步骤
1、酵母细胞破粹（干磨法）
①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵
②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min）
③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl 缓冲液，分2次加研磨10min，
使呈糊状液体；
④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min
（条件：4℃、12000r/min）
⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析
2、热处理
①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min，
并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。
②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min
③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。
（条件：4℃，12000r/min）
④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。
3、有机溶剂（乙醇）沉淀
①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
放置约20min；
②离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心10min；
（条件：4℃，12000r/min）
③收集保存：弃去上清液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl 缓冲液溶解沉淀
留出1mL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管，－20℃冰箱保存。
（用于实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶）
六、实验数据记录和处理
1、实验数据记录
石英砂：；
干酵母粉：；
Tris-HCl提取离心后上清液体积（样品Ⅰ）V1：；
样品Ⅰ热处理离心后上层清液体积（样品Ⅱ）V2：。
2、实验现象：
研磨过程：干酵母颜色变浅，散发出一股难闻的气味；
第一次离心后：上清液澄清颜色土黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色，下层石英砂呈白色；
第二次离心后：上清液更加澄清橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅；
第三次离心前：上清液柠檬黄，沉淀为米白色。
七、实验结