文档介绍：专业:农业资源与环境姓名:李佳怡学号:3130100246日期::生物实验中心310装订线实验报告课程名称:生物化学实验(丙)指导老师:方祥年成绩:__________________实验名称:质粒DNA的微量制备及电泳检测同组学生:金宇尊、鲍其琛一、实验目的和要求(必填) 二、实验容和原理(必填)三、实验材料与试剂(必填)四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填)六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析(必填)八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学****并掌握质粒DNA的提取原理和方法;2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作;3、学****并掌握对电泳检测结果的初步分析。二、实验容和原理1、实验容①质粒DNA的提取②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定实验原理①质粒:质粒是一种染色体(核质体)外的寄生性的自主复制子,存在于细菌等细胞中,为双链闭环的DNA分子,大小在1-200kb之间,具有自主复制和转录功能,能表达例如抗性、菌***等细胞非必需的遗传信息,但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞(细菌)基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移,因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤:a细菌培养使质粒大量扩增;b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA;c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质,分离和纯化质粒DNA。③碱裂解法来分离纯化质粒DNA:在EDTA存在下,经过SDS处理使细胞膜裂解,从而使菌体充分裂解,利用在碱性条件下(NaOH),使核质体DNA与质粒DNA的变性;加入乙酸钾,在中性条件下,核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异,质粒DNA很快得以复性,而细菌核质体DNA分子难以复性,核质体DNA会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来,质粒DNA则留在上清液;上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等,可通过碱性酚-***仿-异戊醇混合液的抽提去除;含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀,这是由于当加入无水乙醇时,其会夺去核酸周围的水分子,使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中()带负电荷,它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即具有不同的相对分子量的DN***段泳动速度不同,并能区分出不同的区带。DN***断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色后,在紫外光下可见橙红色带,并可确定DN***断在凝胶中的位置。⑤影响DNA泳动速率(迁移率)的因素有:DNA分子质量的影响:双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大,迁移率越小。DNA构型的影响:超螺旋DNA>线状DNA>开环DNA。胶浓度的影响:浓度越低,相同核酸分子迁移越快,一般常用的凝胶浓度为1%~2%;电场强度的影响:电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,(一般5V/cm)(电场强度)。而对于大片段电泳,~。进行高压电泳