文档介绍：液相色谱柱的选择,柱填料对C18色谱柱的影响
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关
比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)
根据需要选择合液相色谱柱的选择,柱填料对C18色谱柱的影响
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关
比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)
根据需要选择合适的比表面积
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
多孔材料的95%以上表面在孔内部
样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大
条件： C8色谱柱，×150mm， ，
A溶剂，%TFA水溶液；
B溶剂，%TFA于80%乙腈－ 水中；
20min梯度，10 30%B；60°C，
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径
色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低
• 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
• 窄径柱 ( ) - 检测器灵敏度高
• 宽径柱 (3-) - 载样量高
固定相对色谱柱性能的影响
固定相对色谱柱性能的影响：键合类型
A 纵向交联：保留和选择不稳定
B 横向交联：宽pH适用
C 单体键合：重现性好，柱效高
D 单体（空间保护）：低pH稳定
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
残余硅羟基的影响
普通硅胶当流动相的 pH 值大于 - 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。
解决方法
封尾
双层表面修饰
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
封尾
键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。
缺点：
不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）
在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好
TMS
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
双层表面修饰
降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
硅胶双层表面修饰后
新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=，
更对称的峰型
硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖
重现性更好
表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖
极性化合物保留和分离更好
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
双层表面修饰
代表产品：
StableBond C18，PolarBond C18，SurfBond C18
ng/mL Pseudoephedrine
AUMI Baulo StableBond , ×50mm, 5µm
Brand A C18
×50mm, 5µm
Phenomenex Luna C18, ×50mm, 5µm
固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为
同一厂家相同硅胶基质的反相柱：
保留值随含碳量的增加而增加
比表面积越大，保留值越大
键合碳链越长，保留越大
C18 C8>C3>C1，长链之间差别不大
≈
固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为
不同厂家色谱柱的
保留值，选择性与峰型
色谱柱：*150mm，流动相：乙腈－，(65:35);流速：1ml/min，
拖尾峰
T0（尿嘧啶）
P: 吡啶
L: 苯酚
N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸
J: 甲苯
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
键合硅胶的稳定性
低pH值，键合相流失
高pH值，硅胶溶解
影响色谱柱寿命，方法不重现
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
低pH值，键合相流失
固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性
空间位阻保护，延缓键合相流失
固定相对色谱柱性能的影响