文档介绍：1. DNA ***化检测: Southern Blot 杂交,B isul f iteS equencing and McrBC-PCR a) Southern Blot 将从四周左右大小拟南芥的莲座叶中提取的 DNA ,用对***化修饰敏感的限制性内切酶酶切后于 % 琼脂糖凝胶中电泳, 参照丁勇师兄总结的方法(具体步骤见下),用湿转法将其转至尼龙膜上,80度真空烤 2小时,与探针于 65°C 杂交 16-20 小时,经严谨性洗膜后用 Phosphoimager 进行分析。 PCR primers for amplifying probes: Promoter of FLC FLC -P75: CGAGCAAAGGAATGCAAATT FLC -P42: TATCTACTTTTTC hAT Element within MPF Ty3 -p1: ACAATAAAAT GATAATAGTA AGGC Ty3-p2: CTCACGTTAGTCATGGGTAG 1)基因组 DNA 用限制性内切酶酶切后于是 % 琼脂糖凝胶中电泳,电泳胶图经凝胶成像集后,将胶于变性液中( NaCl, NAOH )变性 45min , 再将胶于中和液中( 1M TisCL , NaCl )中和 45min 。 2) 采用半干转移法用 20× SSC 为转膜液,将基因组转至尼龙膜上,用紫外交联器分别交联系 30秒,并在 80℃下真空干燥 2小时。 3) DNA 探针用 Klenow 酶标记, 方法为:模板: 100-200 μg, Random primer:1 μl (500 ng/ μl), 5mM dNTP( 不含有 dCTP): 2μl,用ddH 2O 补齐为 10μ ℃变性 3-5分钟。冰上放置3分钟。10× Klenow buffer: 2μl,P 32 dCTP: 3μ l, Klenow: 2μ l, 于 37℃中放置 1 小时。再将探针于 99℃变性 3 分钟,冰上放置 3 分钟后加入杂交管中。 4)65℃杂交过夜,经2× SSC , %SDS ,洗膜两次,每次数 10分钟; × SSC , %SDS , 洗膜两次, 每次数 10 分钟后,用 Typhoon 8600(Amersham pharmcia biotech) 进行扫描。变性液: NaCl, NaOH 中和液: 1M Tris, NaCl, pH 调至 杂交液: 磷酸钠缓冲液, pH ,7% SDS , 10mMEDTA 。 b)B isul f iteS equencing Bisulfite sequencing 完全按照 Steve Jacobsen 实验室的 protocol 操作,注意 DNA 的纯度一定要高,否则可能影响后续的酶切以及 Bisulfite 处理。 1)取植物基因组 2μg以上,用两种的限制性内切酶(选择不切检测区域内部的) 大于 100 μl体系过夜酶切,等体积的酚/***仿抽提,加入 2μl糖原和 1/10 体积 NaOAC 助沉, 倍体积的乙醇沉淀。 13000 rpm 离心 15 分钟, 70% EtO H 洗涤沉淀。 2)离心后将沉淀溶于