zj基因工程第章目的基因的合成完全版.ppt

文档介绍：（优选）zj基因工程第章目的基因的合成完全版
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基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒
上述几种载体的最大装载量如下：
质粒 15 kb
λ-DNA 25 kb
考斯质粒 45 kb
BAC 300 kb
YAC 400 kb
用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌
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重组DNA分子的构建
一般选择10uL的连接反应体系，其中DN***段与载体臂之间的摩尔数比为2：1
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重组DNA分子导入受体细胞
一般采用噬菌体颗粒的形式将重组DNA分子导入大肠杆菌细胞中，以提高建立基因文库的效率。
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基因文库的完备性
基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中： N：重组子的数量
P ： 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f ： 克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小
例如， x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，；，基因文库至少需要180万个克隆
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基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力
载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序
克隆片段易于从载体分子上完整卸下
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
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基因文库的扩增、分装及保存
液体培养增殖法；
影印滤膜培养法；
制备转导性裂解物；
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第二节 cDNA基因文库构建
cDNA基因文库的概念

某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDN***段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA文库。 如果此群体中只贮存该基因组cDNA部分，则称为部分cDNA基因文库。
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cDNA基因文库构建的步骤
细胞总RNA的制备及mRNA的分离
cDNA第一条链的合成
双链cDNA的合成
cDNA与载体的连接
噬菌体颗粒的包装
转染或质粒的转化
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mRNA
cDNA
双链cDNA
重组DNA分子
cDNA文库
反转录酶
载体
受体菌
复制
从cDNA文库获取目的基因
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尿素-***化锂法
硫***酸胍法
polyT亲和层析法
密度梯度离心分级法
探针筛选法
mRNA的提取与纯化
AAA
AAA
AAA
AAA
polyT
polyT
polyT
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从mRNA制备cDNA
逆转录酶
ＤＮＡ聚合酶
mRNA
cDNA
杂化双链
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cDNA第一链的合成
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cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
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cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失
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cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
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双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克