文档介绍：Real Time PCR 检测方法原理■嵌合荧光染料检测法(SYBR Green I) SYBR ? Green I 是荧光定量 PCR 最常用的 DNA 结合染料,能与双链 DNA 非特异性结合,结合后发出荧光,可以通过检测反应体系中的 SYBR ? Green I 荧光强度,达到检测 PCR 产物扩增量的目的。通过 PCR 反应生成双链 DNA , SYBR ? Green I 与双链 DNA 结合发出荧光,通过检测荧光不但可以检测反应体系中的 DNA 扩增量,同时还能测定扩增产物的 DNA 融解温度。具体原理见下图。嵌合荧光染料法原理图■双标记荧光探针法双标记荧光探针法是使用 5’端带有荧光物质(如: FAM 等),3’端带有淬灭物质(如:TAMRA 等) 的双标记荧光探针进行荧光检测的方法。当探针完整时, 5’端的荧光物质受到 3’端的淬灭物质的制约,不能发出荧光。而当双标记荧光探针被分解后, 5’端的荧光物质便会游离出来,发出荧光。当 PCR 反应液中加入荧光探针后,在 PCR 反应的退火过程中, 荧光探针便会和模板杂交。进一步在 PCR 反应的延伸过程中, Taq DNA 聚合酶的 5 ’→ 3’ Exonuclease 活性可以分解与模板杂交的荧光探针,游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度,可以达到检测 PCR 产物扩增量的目的。具体原理见下图。双标记荧光探针法原理图■ CycleavePCR 法原理 CycleavePCR 法是由 RNA 和 DNA 构成的杂合 Cycling 探针与 RNase H 组合使用的高灵敏度检测方法,能够高效率地检出目的基因。 Cycling 探针内部夹有 RNA 部分,一端标记荧光物质, 另一端标记淬灭物质, 当探针处于完整状态时, 由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光, 但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后, RNase H在 RNA 部分将探针切断, 淬灭抑制作用解除, 荧光物质发出荧光, 通过测定荧光强度, 能够实时监测扩增产物量