文档介绍：蛋白质测定方法
——化学报告
蛋白质的检测
附表蛋白质测定知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差
,干扰物质较多
,在用标准曲线法测定蛋
白质含量时
,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差
,
故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶
及核酸等吸收紫外
光的物质 ,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表
,再进行计算的方法加以适当的校正。但是
因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的
,虽然经过校正 ,测定的结果还是存在一定的误差。
此外 ,进行紫外吸收法测定时
,由于蛋白质吸收高峰常因
pH 的改变而有变化
,因此要注意
溶液的 pH 值 ,
测定样品时的
pH 要与测定标准曲线的
pH 相一致。取待测样品制成蛋白
浓度大约在 0. 1 ? 1. OmgPmL
的蛋白质溶液，用紫外分光光度计进行比色
，对照标准曲线
得出样品含氮量。每个样品做
3 次重复测定 ,
取平均值。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲 ( NH3CONHCONH3) 是两个分子脲经 180 C 左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性
溶液中，双缩脲与 CuS04 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键，
或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓
度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成
分无关，故可用来测定蛋白质含量。
此法的优点是测定较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少；主要
的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测
取待测样品制成蛋白浓度大约在 1? 10mgPmL 的蛋白质溶液，加双缩脲试剂染色 30min, 用可见光分光
光度计进行比色，对照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做 3 次重复测定，取平均值。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
由于双缩脲法 ( Biuret 法 )存在明显的缺点和许多限制，因此 1976 年由 Bradford 建立的考马斯亮蓝法
(Bradford 法 ) ，这是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法
的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵
敏度最高的蛋白质测定法。
Bradford 法的突出优点是：
a. 灵敏度高。据估计，比 Lowry 法约高 4 倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质 -染料复合物有更高的消光系数，因而光
吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大得多。
b. 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5min 左右。由于染料与蛋白质
结合的过程，大约只要 2min 即可完成，其颜色可以在 1h 内保持稳定，且在 5
? 20min 之间，颜色的稳定性最好，因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。
干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K 、N 且小独离子、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 EDTA
等均不干扰此测定法。
此法的缺点是
a.
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基
酸的含量不同
，
，因此 Bradford 法用于不同蛋
白质测定时有较大的偏差
-球蛋白为标准蛋白质
，
在制作标准曲线时通常选用丫
以减少这方面的偏差。
b. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有去污剂、 TritonX- 100 、十二烷基硫酸钠 ( SDS) 和
0. 1N 的 NaOH 。 ( 如同 0. 1N 的酸干扰 Lowry 法一样 ) 。
c. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定