文档介绍：第二节蛋白质一级结构的测定方法演示文稿
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优选第二节蛋白质一级结构的测定方法
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由于克隆核苷酸序列比测定核苷页，共84页，星期日。
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③ Cleland‘s试剂的还原作用
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稳定SH基的方法：
（A） 烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物
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稳定SH基的方法： （B）氨乙基化
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非共价结合
尿素， SDS-PAGE，盐酸胍， 高浓度的盐
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2）末端分析
（1）N-末端测定
A. 二硝基***苯法(FDNB，DNFB)
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（1）N-末端测定 B.***酸盐法 异硫***酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的α－氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂称为Edman试剂。 由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。
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（1）N-末端测定 ***氨基萘磺酰***法
在碱性条件下，丹磺酰***（二甲氨基萘磺酰***DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-肽。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
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氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
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2）末端分析 （2）C-末端分析
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。
Gln（谷氨酰***）、Asn（天冬酰***）、Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产生游离的羧基末端aa。
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（2）C-末端分析
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
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羧肽酶法测
C 末端
羧肽酶法
羧肽酶A：
除Pro、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）外的所有C端氨基酸
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
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C-末端分析 C. C-端氨基酸选择性氚标记法：
使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）
还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成－氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定－氨基醇的类别。
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酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来用4 mol/L的***磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。
缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰***和谷氨酰***侧链的酰***基被水解成了羧基。
-COO+
3）氨基酸组成分析
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碱水解
一般用5 mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，1100C煮沸10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到