文档介绍：分子克隆实验基本流程
根据生物信息学方法找到自己要克隆的目标蛋白基因序列，设计引物交给生物公司合成，同时准备好模板（cDNA库或者plasmid收到引物后按照说明书处理引物，然后就可以PCR目标蛋白的基因了。
PCR 体系（50 微分子克隆实验基本流程
根据生物信息学方法找到自己要克隆的目标蛋白基因序列，设计引物交给生物公司合成，同时准备好模板（cDNA库或者plasmid收到引物后按照说明书处理引物，然后就可以PCR目标蛋白的基因了。
PCR 体系（50 微升）：primerstar premix 25 微升
Upstream primer 1 微升
Downstream primer 1 微升
模板（template ） 1微升
ddH2O 22 微升
说明：生物公司提供的primerstar premix是预混好的,浓度是2*的，其中包含了 DNApok dNTP、Mg?+等（具体可以看说明书）。模板浓度不需要特别高，因为PCR可以检测到痕量的DNA。注意：对于含primerstar premix的样品尽量在冰上操作，防止其中的酶变性失活。另外在PCR小管中添加各成分时请集中注意力，不要错加漏加，尽量不要说话，保持清洁的环境，避免污染等。
PCR结束，取少量PCR产物进行核酸电泳：1 %琼脂糖核酸胶（ agrose+30ml 1*TAE）
凝胶成像仪看电泳结果：1、没有目标条带，分析原因：退火温度Tm不合适？引物加错了没有或者少加了？。。。退火温度Tm可以再次拉梯度PCR等
2、条带不够亮:确定电泳loading buffer没有问题时可以以PCR
产物为模板再次PCR,或者增加循环次数，一般PCR30个循环，可以增加到35个循环等。
3、 PCR条带很亮：切胶回收（有杂带时）或者无胶回收（目标条带单一很纯很亮时）模板条带。（根据回收试剂盒说明书操作即可）
酶切目标基因和载体（露出粘性末端，便于与载体接合）
体系（30微升）：需要酶切的基因/
酶1 1微升
酶2 1微升
10*buffer计算获得
ddH2O 计算获得
说明：1、这个体系并不是固定的，各种成分的量可以变动，如可以多加一些需要酶切的基因，但是为了保证酶切效果一般不会过多添加需要酶切的基因/载体，而是会变动酶的量。不同的酶需要的buffer不同，对于buffer的浓度不同（具体参照说明书）。一般过夜酶切效果好。注意酶切的温度！
2、根据平时的实验，载体相对基因更难以切开，因此可以适当增加酶的量，比；延长酶切时间，如过夜；另外还可以在酶切一段时间后再次添加酶继续酶切一段时间。实验证明最后一种方法比较好用。
无胶回收酶切好的基因/载体
将酶切好的基因和载体链接。
体系（10微升）：

5 微升 solution I
一般16度水浴锅过夜连接效果较好，也快根据说明说操作。
将连接产物转化到克隆菌株（如TOPIO, DH5a）中，目的是或者大量扩增的目标质粒。
操作步骤：从超低温冰箱中取出感受态菌，冰中放置5min （复苏）一加入全部的连接产物，冰中放置30min-42度水浴热击90秒，冰中放置5min一加入500微