文档介绍：实验报告
课程名称：生化实验B 实验日期：
班级： 姓名学号：
血红蛋白凝胶过滤
背景及目的
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。 百度百科 层析 #2
凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。
本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。
仪器与试剂、实验材料
仪器
⑴ 层析柱 ⑵ 恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂） ⑶ 胶头滴管
⑷ 50ml烧杯 3个 ⑸ 玻璃棒
试剂
⑴ 磷酸缓冲液（老师已配好）
⑵ 还原层试剂 （1:1的40nM FeSO4和80 mMNa2H2EDTA,, ,老师提供）
⑶ Sephadex G-25
实验材料
血红蛋白样品（1ml抗凝血加10ml pH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）
实验步骤
凝胶溶胀：老师已准备好
2 、 检验： 旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。上下端倒置，按上述步骤检验。
3、 装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。过程中调节好流速，6滴/分。平衡过程20分钟。
4、 上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。确定流速后准备上样。利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。，小心注入胶床液面中央。开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。，开泵，至