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浅谈 RT-PCR 实验方法中常见污染问题及对策
河南出入境检验检疫局技术中心李轲
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是一种体外核酸扩增技术,它具有特异、敏感、
快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点,能在几个小时内完成从一根毛发、
一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定,所以近
年来 RT-PCR 技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一直从事
实验室动物疫病检测工作,现就应用 RT-PCR 实验方法过程中出现的一些常见污
染问题做如下论述,仅共同行参考和探讨。 RT-PCR 实验有三步:提取 RNA、
反转录(RT)、PCR 扩增及扩增产物分析,在这一过程中,最令人头痛的问题是
易污染,极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面: 1、
样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的,如重复使用,应在使用前
应于 180℃的高温下干烤 6 小时或更长时间;样品存放时要密封严实,以防外溢
造成相互间的交叉污染;样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性
的,以免不同实验样品间相互污染;由于吸样枪污染会导致样品间的污染,也是
一个值得注意的问题,由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个
严重的污染源,因而加样或吸取时要十分小心,吸时要慢,吸取尽量一次性完成,
忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;同时要注意操作时不要剧烈地摇
动反应管,开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多,会造成环境污染,
不仅会导致实验失败,而且也会损害操作人员身体健康,因此每次实验完毕都要
及时清理实验台面,用 %次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。 2、
RT-PCR 本身使用的试剂污染在试剂配制过程中,由于加样枪、容器及其它溶液
被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装,以减少重复加样次数,避免污染机会,
另外 RT-PCR 试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消
毒和紫外线照射消毒。 3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题,极微量的
扩增产物污染就可造成假阳性,每次实验完后,扩增产物都要及时密封后处理。
在做 RT-PCR 实验时,一般都应设阳性对照,操作不慎,污染可能性很大,因而
当某一 RT-PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员经验丰富心中有数时,在以后的
实验中可免设阳性对照,或间隔性设阳性对照,以减少污染机会