文档介绍：RT-PCR法检测MYCT-1基因在GES-1细胞中的表达
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【摘要】目的检测MYCT-1(myc target)基因在胃黏膜GES-1细胞系中的表达,探讨GES-1细胞作为RNA干涉细胞模型的价值。方法用TRIZOL法提取GES-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增MYCT-1 cDNA,DNA测序验证。结果在GES-1细胞中检测到504bp MYCT-1 cDNA片段,测序证实与GenBank报道序列完全一致。结论 GES-1细胞中存在MYCT-1表达,可作为RNA干涉细胞模型。
【关键词】 MYCT-1;GES-1细胞系;RT-PCR
MYCT-1(myc target 1)是本室克隆的新候选抑癌基因,GenBank登录号NM_025107[1],曾命名MTLC(myc target from laryngeal cancer cells)。前期研究表明MYCT-1广泛表达于多种正常组织,且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达下调[2~5]。为进一步研究MYCT-1基因的生物学功能及在肿瘤发生、发展中的作用,准备用RNA干扰(RNA interence, RNAi)技术沉默正常细胞中MYCT-1的表达,以了解MYCT-1低表达对正常细胞生长特性、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。本文用RT-PCR法和DNA测序检测胃黏膜GES-1细胞中MYCT-1的表达,探讨GES-1细胞作为RNA干涉模型的价值。
1 材料与方法
材料 GES-1细胞(肿瘤研究所);TRIZOL试剂、1640培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司);反转录酶、Taq酶(Promega公司);MYCT-1引物(大连宝生物公司),序列为:正向引物:5’-TGCACTGGCTGATGAGTGTGTA-3’;反向引物:5’-TCGA GGT-3’;其他试剂均为国产分析纯。
×105 GES-1细胞接种至35mm培养皿中,加入含10%胎牛血清1640培养基,在5%CO2、37℃条件下培养,%胰酶消化传代,4h后细胞贴壁生长,24h后进入对数生长期。
总RNA提取取对数生长期GES-1细胞1×106加入1ml TRIZOL 试剂,匀浆后室温静置5min,,室温放置2~3min。4℃、12000rpm离心15min,将上清液移至另一新管,,室温放置10min,4℃、12000rpm离心10min,弃上清液,加75%乙醇(DEPC处理水配制)1ml,涡漩漂洗1次,4℃ 7500rpm离心5min,弃上清液,空气干燥15min,% DEPC-treated water,置55℃~60℃水浴中孵育10min,取少量用于RNA含量及纯度测定,其余分装后置-70℃冰箱保存。
cDNA的合成用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链,反应体积10μl,反应体系中加入:,Oligo(dT),25mmol /L MgCl2 ,10mmol/L dNTP ,10×buffer