文档介绍：第二章 DNA克隆技术
本章，我们讨论4个问题：
1. 什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。
2. 为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理和技术路线。
——DNA克隆技术的步骤DNA 双链DNA
辅因子 Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP
识别序列特异特异特异
切割位点非特定特定特定
识别序列前后之中之后25bp~27bp
100-1000bp
修饰作用有无有
限制酶的识别位点
一般特征（4点）：
（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。
（2）它能识别DNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。
（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：

(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。
若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：
① 要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256
② 同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。
GGATCC
CCTAGG
BamH Ⅰ
特点
Ⅱ型限制酶：
识别4-6个核苷酸
识别的核苷酸具有回文结构
可以形成平末端、粘末端
切口概率
星号活力
星号活力定义：
限制酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别的序列类似的序列的现象。
影响因素：甘油浓度过高，低离子强度，限制酶用量过大，高PH，有机溶剂污染
表示方法：在相应的酶上加星号表示。
如：EcoR Ⅰ（*）
如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；
5′－G↓AATT C－3′ 5′－G-OH p-AATTC－3′
3′－C TTAA↑G－5′ 3′－CTTAA G－5′
PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：
5′－C TGCA↓G－3′ 5′－CTGCA-OH p-G－3′
3′－G↑ACGT C－5′ 3′－G ACGTC－5′
还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）如SmaI:
5′－CCC↓GGG－3′ 5′－CCC GGG－3′
3′－GGG↑CCC－5′ 3′－GGG CCC－5′
Ⅱ型限制酶切口特点
1．异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：
(1)识别顺序与切割方式同，如：
MboⅠ和 SauSⅠ（－NN↓GATCNN-3′）
-NNCTAG↓NN-5′
(2)识别顺序同，切割位点不同，如：
SmaⅠ CCC↓GGG 和 XmaⅠ C↓CCGGG
(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（***化*），另一酶不能。如：
HpaⅡ→CCGG 和 MspⅠ→CCG*G

MboⅠ→GATC 和 Sau 3A →GA*TC
几种特殊的内切酶

HpaⅡ CC↓GG SmaⅠ CCC↓GGG SmaⅠ的6个bp含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡ 能识别与切割SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg的其它6核苷酸顺序不能被SmaⅠ切割。
3．同尾酶
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
BamHⅠ G GATC