文档介绍：*
内容
实验目的
1
实验原理
2
实验材料
3
实验过程
4
5
注意事项
第一页，共二十六页。
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实验目的
掌握盐析法分离蛋白质的原–球蛋白pI ＞，
带正电荷
清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附,
g-球蛋白被洗脱

DEAE带正电荷
缓冲液离子强度增加
清蛋白被洗脱
第十六页，共二十六页。
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第十七页，共二十六页。
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（电泳）
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果
第十八页，共二十六页。
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球蛋白
1
2


等电点

~
相对分子量（×104）

20
30
9~15
~30
含量（％）
57~67
2~5
4~9
~12
12~20
血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量
清蛋白 A
第十九页，共二十六页。
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醋酸纤维素薄膜电泳原理
血清中各种蛋白质的等电点不同，。，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
第二十页，共二十六页。
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醋酸纤维素薄膜电泳
1. 点样(粗面)
8cm
2cm
点样线
点样区

(粗面）
点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多
－
＋
小组标记
样品标记
第二十一页，共二十六页。
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2. 电泳
薄膜粗面向下
点样端置阴极端
两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平
注意：切勿使点样处与电泳槽接触
电压：110V
时间：50min。
第二十二页，共二十六页。
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3. 染色和漂洗
电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。
取出膜，用滤纸吸干即可。
第二十三页，共二十六页。
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质
，，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min
沉淀（含球蛋白）加水
上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质
凝胶柱层析除盐
磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有蛋白质的峰液12d
此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性
继续用2ml NH4AC缓冲液洗涤
BaCl2检测SO42-阴性
用2~3ml NH4AC缓冲液再生平衡
过葡聚糖凝胶G-25层析柱（×7cm）
过葡聚糖凝胶G-25层析柱（×7cm）
磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有蛋白质的峰液12d
此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性
继续用 2ml NH4AC缓冲液洗涤
BaCl2检测SO42-阴性
用2~3ml NH4AC缓冲液再生平衡
盐析
操作流程
离子交换柱层析纯化
加样
加样
第二十四页，共二十六页。
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５mL NH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白
离子交换柱层纯化
除盐后收集的清蛋白
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质
取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）
磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管
DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白
除盐后收集的球蛋白
过DEAE-纤维素层析柱（×6cm）
过DE