文档介绍：(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110982816 A
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(21)申请号 201911313173 .8 (22)申请日 2[0003] 本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种获得高硬脂酸油菜的方法，该
高硬脂酸油菜是通过基因编辑手段获得。
[0004] 本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：
[0005] 本发明所提供的获得高硬脂酸油菜的方法，包括以下步骤：
[0006] S1,根据甘蓝型油菜BnSADl .A3和BnSADl .C3基因的核昔酸序列设计并筛选五个碱
基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；
[0007] S2,构建五靶点基因编辑载体pBnSAD 1载体；
[0008] S3, pBnSADl载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得高硬脂酸油菜。
[0009] 其中，所述五个碱基位点的靶点序列(5‘ -3')分别见SEQ ID NO： 4、SEQ ID NO： 5、 SEQ ID NO： 6、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO： 8。
[0010] 其中，所述靶点序列的引物序列分别见SEQ ID NO：9、SEQ ID NO： 10> SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO： 12、SEQ ID NO： 13、SEQ ID NO： 14、SEQ ID NO： 15、SEQ ID NO： 16、SEQ ID
NO： 137、SEQ ID NO： 18。
[0011] 其中，所述BnSADl .A3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO： 2所示；所述BnSADl ,C3拷贝的碱基序列如SEQ ID NO： 3所示。
[0012] 本发明步骤S2中构建五靶点基因编辑载体pBnSADl载体的步骤包括：
[0013] e、靶点接头制备；
[0014] f、靶点接头引物与sgRNA表达盒的连接和扩增；
[0015] g、靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接；
[0016] h、转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证，得到最终载体；
[0017] e、将连接成功的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，得到pBnSADl载体农杆菌菌株。
[0018] 其中，所述BnSADl .A3和BnSADl .C3基因是根据拟南芥fab2基因进行基因家族分析得到的。
[0019] 本发明还提供了上述利用基因编辑技术获得高硬脂酸油菜的方法在油菜育种中
的应用。
[0020] 本发明具有以下有益技术效果：
[0021] 本发明根据甘蓝型油菜BnSADl .A3和BnSADl .C3基因的核昔酸序列设计并筛选了
五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物，然后构建五靶点基因编辑载体 pBnSADl载体，并将该载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，可以不同程度的提高油菜硬脂酸的含量，本发明为甘蓝型油菜高硬脂酸育种提供了新的途径，提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。
附图说明
[0022] 图1为突变体植株PCR阳性检测鉴定结果图；
[0023] 图2为阳性单株PCR编辑检测结果图；
[0024] 图3为突变体植株和野生型甲9707种子中硬脂酸含量的检测结果图。
[0025] 图4为五靶点基因编辑载体pBnSAD 1载体的示意图。
具体实施方式
[0026] 以下结合具体实施方式对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用
于限定本发明的范围。
[0027] 本发明所用的试剂均市售可得，所用载体、质粒均为本领域公知公用。
[0028] 下述实施例中涉及到的培养基如下：
[0029] LB培养基(1L)：蛋白月东10g,酵母提取物5g,***化钠10g,固体培养基加琼脂15g/L,
121°。高压灭菌20111垣，4°C冰箱贮存备用。
[0030] DM( 100ml)： MS ,蔗糖3g,定容，调PH = 5 .84-5 .88,灭菌，快冷使用时加抗生
素 AS( ) 1 OOpl。
[0031] M0( 100ml)： 1/2MS ,蔗糖3g,定容，调PH = -,加Agar ,灭菌。
[0032] Ml(500ml)： MS ,蔗糖 15g, Mannitol 9g, 2,4-D(lmg/L), KT(0,3mg/L)
0 ,5mb定容，调PH=5 .84-5 .88,加Agar ,灭菌，(100四m)500四 lo
[0033] M2(500ml)： MS ,