文档介绍：实时荧光pcr检测貉子源性成分的引物探针及方法
实时荧光pcr检测貉子源性成分的引物探针及方法
本发明公开了一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于34;
待测样品貉子源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出貉子源性基因；待测样品貉子源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出貉子源性基因；待测样品貉子源性基因检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于400且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出貉子源性基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出貉子源性基因。
[0007]本发明提供了一种实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析畜肉食品中是否含有貉子源性成分，发挥了实时荧光PCR检测技术的优点，进一步完善了食品检测体系，加大对消费者利益的保护力度。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是本发明实施例1检测貉子源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，I为絡子肉制品；2，3为絡子肉制品；
图2是本发明实施例2检测貉子源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，I为貉子肉制品；2为絡子肉制品。
[0009]【具体实施方式】:实施例1
:
选择貉子线粒体d-loop基因作为对象，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针；
实时荧光PCR引物和探针序列包括:
上游引物 P1: CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC;
下游引物 P2: GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA;
探针:CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC,，。
[0010]:
，
mL CTAB裂解液及50 μ?蛋白酶K溶液，涡旋震荡30 s后，颠倒混合5次，65 1:水浴过夜(12h-16h)。室温12 000 r/min离心10 min，取上层溶液800μ?,加入等体积的Tris饱和酚/三***甲烷/异戊醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温12 000 r/min离心10 min ;取上层清液(水相)于一新离心管中，加入等体积的三***甲烷，颠倒混匀，室温12 000 r/min离心10 min，取上清液600 μ?。将上清液移至一新离心管，，混匀，4 °C静置30 min ,4 °C, 12 000 r/min离心10 min,小心弃去上清液，向沉淀加入500 μ? 70%冷乙醇，洗涤沉淀，4 °C，12 000 r/min离心5 min，小心倒出上清液，室温干燥后，将DNA溶于200 PL去离子水中，-20 ℃保存。
也可使用等效的商品化